Работы по ремонту оборудования Прибор для проведения полимеразной цепной реакции Rotor Gene 6000, модель 6600-100, Corbet Researсh Pty Ltd. серийный номер R050882 в сервисном центре
Дата окончания приема заявок: 05.12.2019, 00:00 2019-12-05 00:00:00
номер закупки в системе: 13227528
Способ размещения: запрос котировок
Дата начала: 28.11.2019, 08:24
Лоты (1 шт)
Регионы, заказчики, места поставки:
Регионы
Заказчик
Место поставки
Самарская область
доступно клиентам компании
доступно клиентам компании
Объекты лота:
Наименование
Цена за ед.
Кол-во
Ед. изм.
Сумма
Услуги по ремонту и техническому обслуживанию облучающего, электрического диагностического и электрического терапевтического оборудования, применяемого в медицинских целях
91 836,31
1
Условная единица
91 836,31
Дополнительная информация
Журнал изменений
Похожие тендеры
Поставка реагентов для проведения иммунохимических исследований на анализаторе Abbott Arсhiteсt.
15 133 369 RUB
Поставка реактивов для гематологического анализатора Mindray BC-3600
265 396 RUB
907-U020-19/953 Диагностика и ремонт оборудования спектрофотометр Cary 5000 Agilent Teсhnologies
334 731 RUB
Поставка термобумаги для биохимического экспресс-анализатора Quo-Test Analyzer System, имеющегося у.
7 490 RUB
Оказание услуг по ремонту вертикально-фрезерного станка модель Frits-werner 3-230
Для восстановления пароля введите адрес электронной почты, указанный Вами при регистрации.
Мы с удовольствием ответим на все ваши вопросы, связанные с работой информационной системы. Оставьте свое сообщение, и наши специалисты свяжутся с вами в ближайшее время.
Мы с удовольствием ответим на все ваши вопросы, связанные с работой информационной системы. Оставьте заявку на звонок, и наши специалисты свяжутся с вами в ближайшее время.
Источник
Техническое обслуживание приборов Rotor-Gene
Участники и результаты
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский Государственный Центр Качества и Стандартизации Лекарственных Средств Для Животных и Кормов»
44-ФЗ, Электронный аукцион
Чтобы смотреть документы в системе, даже когда zakupki.gov.ru не работает, нужно оплатить систему
ИНН 7703056867 КПП 770301001
Наименование
Кол-во
Цена за ед.
Стоимость, ₽
Техническое обслуживание оборудования 6500-100 Прибор для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени серийный номер R 1112180 (прибор для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Rotor-Gene Q с принадлежностями, вариант исполнения Rotor-Gene Q 5plex)
ОКПД2 33.12.29.000 Услуги по ремонту и техническому обслуживанию прочего оборудования специального назначения
Техническое обслуживание оборудования 6500-100 Прибор для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени серийный номер R 0511113 (прибор для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Rotor-Gene Q с принадлежностями, вариант исполнения Rotor-Gene Q 5plex)
ОКПД2 33.12.29.000 Услуги по ремонту и техническому обслуживанию прочего оборудования специального назначения
Техническое обслуживание оборудования Прибор для проведения полимеразной цепной реакции серийный номер R 100774 (прибор для проведения полимеразной цепной реакции Rotor Gene 6000)
ОКПД2 33.12.29.000 Услуги по ремонту и техническому обслуживанию прочего оборудования специального назначения
Техническое обслуживание оборудования 6500-100 Прибор для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени серийный номер R 1112188 (прибор для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Rotor-Gene Q с принадлежностями, вариант исполнения Rotor-Gene Q 5plex)
ОКПД2 33.12.29.000 Услуги по ремонту и техническому обслуживанию прочего оборудования специального назначения
Техническое обслуживание оборудования 6500-100 Прибор для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени серийный номер R 060715 (прибор для проведения полимеразной цепной реакции Rotor Gene 6000)
ОКПД2 33.12.29.000 Услуги по ремонту и техническому обслуживанию прочего оборудования специального назначения
Техническое обслуживание оборудования Прибор для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени серийный номер R 060777 (прибор для проведения полимеразной цепной реакции Rotor Gene 6000)
ОКПД2 33.12.29.000 Услуги по ремонту и техническому обслуживанию прочего оборудования специального назначения
Источник
Термоциклер rotor — gene тм 6000 для проведения пцр с детекцией в режиме «реального времени»
Rotor — Gene ТМ 6000
для проведения ПЦР с детекцией
в режиме «реального времени»
Технические характеристики прибора Rotor-Gene 6000 6
Поддержка пользователей 7
2. Описание Rotor-Gene 8
2.1 Принципы работы системы 8
2.2 Система термоциклирования 9
2.3 Оптическая система мультиканальной детекции 12
Схема оптической системы 13
Описание каналов 14
2.4 Типы роторов 15
3. Элементы прибора и комплектующие 17
3.1 Распаковка прибора 17
3.2 Дополнительные принадлежности прибора 18
3.3 Прочтите перед работой с прибором 21
4. Установка и обслуживание 23
4.1 Установка прибора 23
4.2 Обслуживание системы 24
4.3 Установка и обновление программы 25
Установка программы 25
Версия программы 27
Обновление версии программы 28
Что нового в программе? 28
5. Подготовка к проведению анализа 30
Подготовка пробирок с реакционной смесью 30
Подготовка Gene-Disc 32
Включение прибора Rotor-Gene 35
6. Запуск Анализа. Мастер Старта и Шаблоны 35
Мастер быстрого старта / Quick Start Wizard 36
Выбор типа ротора 36
Подтверждение профиля термоциклирования 37
Сохранение анализа 37
Таблица образцов 38
Детальный Мастер / Advanced Wizard 39 Мастер Детальной установки параметров 39
Первое окно: выбор ротора 39
Третье окно: редактор профиля и установки каналов 41
Sybr Green I , FAM , TET , JOE , VIC , HEX , ROX, TAMRA, CY3, CY3.5, CY5, CY5.5, Oregon Green™, CAL Red™, Red 640, Texas Red
глубина – 420 мм, глубина c открытой крышкой – 560 мм
не более 560 Вт
Минимальные требования к компьютеру
Pentium iV , 2 ГГц,
512 M б RAM , HDD 10 Гб,
свободный USB порт или COM порт
Возможный объем реакционной смеси
Функция HRM: плавление с высоким разрешением
Опционально (при соответствующей конфигурации).
Функция Измерение концентрации ДНК
Позволяет напрямую измерять коцентрации нуклеиновых кислот, используя флуоресцентные красители (такие как PicoGreen ®, RiboGreen ® и др)
Rotor — Gene 6000 отвечает требованиям по электробезопасности для оборудования I класса по ГОСТ 12.2.025-76.
Для обеспечения стабильности работы системы, состоящей из термоциклера и компьютера, рекомендуется использование источника бесперебойного питания (ИБП) с максимальной мощностью не менее 1 кВт и временем поддержания напряжения питания, в случае перебоев в электропитании, не менее 20 минут.
1. Введение
Добро пожаловать в программу Rotor-Gene 6000 версии 1.7. Это справочное руководство поможет пользователю в постановке тестов или экспериментов и анализе данных.
Система для амплификации ДНК с детекцией в режиме реального времени Rotor-Gene является открытой платформой, позволяющей использовать любой формат реагентов, применяемых для такого рода анализа. Программное обеспечение предоставляет возможность проведения ПЦР-анализа с использованием любого формата реакции амплификации и анализа получаемых данных.
Ознакомьтесь с разделом « Что нового в программе» чтобы узнать об изменениях и новых функциях, введенных в эту версию программы.
Для всех пользователей осуществляется полная техническая и информационная поддержка, включающая в себя профессиональный и эффективный ответ на все возможные вопросы и требования.
Пользователи в России могут направлять свои запросы по адресу:
Москва, 105064, Б.Казенный пер., 10, стр. 3
Тел.:(495) 105 05 54 • Факс: (495) 916 18 18
Главный офис компании Corbett Life Science :
14 Hilly Street
Mortlake, NSW, 2137
Телефон : 1800 803 915
T: +61 (02) 9736 1320
F: +61 (02) 9736 1364
E: orders@ (NSW, ACT, VIC, TAS, QLD and NT)
Возможные конфигурации системы
Возможны следующие варианты конфигурации системы Rotor — Gene 6000:
Вариант 6200: 2 канала – Green, Yellow;
Вариант 62 H 0: 2 канала – Green, Yellow + HRM (с функцией Плавление высокого разрешения);
Rotor-Gene 6000 – это термоциклирующая система для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (реал-тайм), используемая для амплификации ДНК и флуоресцентной детекции продуктов амплификации. В конструкции Rotor-Gene используется инновационное решение — роторный реакционный модуль. Rotor-Gene 6000 позволяет проводить амплификацию и детекцию с последующим количественным анализом содержания ДНК-мишени или (и) генотипированием исследуемых образцов. Термоциклер обеспечивает работу со всеми известными форматами ПЦР в режиме реального времени, включая использование зондов с двойной меткой (формат TaqMan , формат Molecular Beacons и др.), FRET -анализ и использование интеркалирующих красителей (например, Sybr Green I ). Rotor-Gene 6000 используется для проведения исследований в различных областях – в медицине, сельском хозяйстве, а также фундаментальных исследований в молекулярной биологии.
Мощное и удобное, интуитивно понятное пользователю программное обеспечение обеспечивает простоту использования для начинающих пользователей и при этом предоставляет чрезвычайно широкие возможности. В новой версии программы 1.7 интерфейс стал еще более дружественным пользователю, при этом обогащены возможности анализа данных.
В соединении с автоматической системой для выделения и очистки нуклеиновых кислот ( Xtractor — Gene ) и системой автоматической подготовки реакции ( CAS 1200 ), Rotor-Gene 6000 может быть интегрирован в полностью автоматизированную систему для проведения всех этапов ПЦР-анализа с детекцией в режиме реального времени, обеспечивающую высокую производительность и точность при обработке образцов.
2.2. Система термоциклирования
В приборе Rotor-Gene 6000 используется сложная система нагревания-охлаждения, обеспечивающая точное выполнение заданного температурного режима термоциклирования и оптимальные условия реакции для эффективной амплификации и детекции.
• Диапазон температур – до 99°С
• Точность температуры ±0.2°С
• Разрешение (шаг) температуры ±0.02°С
• Равномерность температуры в образцах ±0.01°С
• Скорость изменения температуры воздуха в камере – 10°С/сек
Именно глубоко продуманный роторный формат реакционного модуля в Rotor-Gene 6000 обеспечивает высокую точность получаемых данных за счет максимальной равномерности температуры для всех образцов, что является ключевым моментом при проведении ПЦР-анализа.
Ротор с образцами постоянно вращается во время анализа со скоростью 400 оборотов в минуту. Такое центрифугирование не создает градиента концентраций, не мешает протеканию реакции, при этом препятствует образованию конденсата на крышках пробирок и устраняет пузырьки воздуха, попавшие в раствор. Таким образом, пробирки перед постановкой в прибор нет необходимости центрифугировать.
Образцы нагреваются и охлаждаются в потоке воздуха, создаваемого воздушным вентилятором. Нагревание воздуха обеспечивается с помощью никель-хромового элемента в крышке прибора. Охлаждение реакционной камеры осуществляется путем обдува воздухом, забираемым снаружи снизу прибора, при этом воздух находившийся до этого в камере выдувается наружу через отверстия в верхней части прибора.
Рисунок. Схема системы нагревания-охлаждения Rotor — Gene 6000
Воздушный клапан закрывает камеру с содержащимся в ней воздухом
Включаются нагревательные элементы
в роторе позволяют воздуху свободно циркулировать
Отверстия в роторе позволяют воздуху свободно циркулировать
После завершения выполнения заданной программы термоциклирования прибор выполнит охлаждение образцов и камеры до безопасной (комнатной) температуры.
2.3. Оптическая система мультиканальной детекции
Оптическая система мультиканальной детекции Rotor-Gene 6000 включает до 6 каналов для детекции излучения различных флуорофоров, предоставляя широкие возможности для проведения мультиплексных реакций. Постоянная длина оптического пути при детекции всех образцов обеспечивает максимальную воспроизводимость и точность детекции флуоресцентного сигнала каждого из образцов. Оптическая система Rotor-Gene 6000 не требует ни проведения калибровки, ни компенсации искажений при измерении, используемых в других системах.
Когда пробирки с образцами в ходе вращения проходят перед модулем детекции светодиод с высокой энергией снизу освещает образец для возбуждения флуоресценции в реакционной смеси, и фотоэлектронный умножитель, находящийся сбоку, детектирует энергию флуоресцентного излучения, проходящего через соответствующий светофильтр. При этом излучение проходит через тонкие стенки пробирки в нижней ее части. Эти данные пересылаются на персональный компьютер, который усредняет сигнал для каждого образца, измеренный за каждый из оборотов. Эти данные выводятся на экран в режиме реального времени в форме графика зависимости флуоресценции от номера цикла ПЦР или от температуры. Постоянная длина оптического пути в ходе измерения для каждого из анализируемых образцов обеспечивает максимальную точность и воспроизводимость измерения независимо от положения образца в роторе. При этом совершенно не нужно использовать пассивный краситель (флуорофор) для нормализации данных.
Рисунок. Оптическая система прибора Rotor — Gene 6000
Пробирки в роторе вращаются, проходя между источником света и детектором
Источники света — светодиоды
В приведенной ниже таблице представлены характеристики 6 каналов, которые можно использовать для проведения мультиплексного анализа, и специального канала для проведения анализа с плавлением высокого разрешения (High Resolution Melt). Для каждого канала указаны флуоресцентные красители, которые можно детектировать с его помощью.
Cy5™, Quasar® 670, LC Red 640®, CAL Fluor® Red 590
Quasar® 705, LC Red 705®, Alexa Fluor® 680
High Resolution Melt (плавление с высоким разрешением)
Для проведения мультиплексного анализа наиболее рекомендуется использовать набор флуорофоров FAM, JOE, ROX и Cy5, поскольку при их использовании перекрестные помехи после оптимизации не превышают 1%.
В качестве гасителей для вышеуказанных флуорофоров можно использовать следующие: BHQ-1 (480-580нм), BHQ-2 (550-650нм), BHQ-3 (620-730нм), а также TAMRA для FAM или JOE (VIC).
Для проведения анализа в формате «FRET-зондов» рекомендуются следующие установки каналов. Для детекции в формате «FRET-гашения» используется канал, соответствующий флуорофору, например, для пары FAM-BHQ1 используется зеленый канал Green, а для пары JOE-BHQ1 – желтый канал Yelloy. Для детекции обычных «FRET-зондов» используются каналы приведенные в таблице:
FAM-Cy5, FAM-LC Red 640
530nm / 712nm long pass
JOE-Cy5, JOE-LC Red 640
470nm / 712nm long pass
2.4 Типы роторов
В системе Rotor — Gene 6000 доступны для использования 3 типа роторов, каждому из которых соответствует свой тип используемых с ним пробирок.
2.4.1 Ротор 36-луночный
Этот ротор со своим фиксирующим кольцом предназначен для работы со стандартными пробирками объемом 0,2 мл, которые используются в большинстве случаев. Используют обычные пробирки с плоской крышкой. Допускается также использовать пробирки с выпуклой крышкой. Поскольку детекция в системе Rotor — Gene 6000 проводится через стенки пробирки в ее нижней части, не требуется использовать специальные пробирки с оптически прозрачной крышкой.
Убедитесь, что пробирки хорошо закрыты, плотно надавливая на крышки пробирок. Во избежание открывания пробирок при работе с Rotor-Gene используется фиксирующее кольцо.
2.4.2. 72-луночный ротор
72-луночный ротор и его фиксирующее кольцо предназначены для работы со специальными пробирками объемом 0,1 мл, стрипованными по 4 штуки. Эти пробирки и крышки к ним выпускает компания « Corbett Research ». Использование этих пробирок позволяет уменьшить объем реакционной смеси до 5 мкл. Крышки обеспечивают безопасное и надежное закрывание пробирок.
2.4.3. Ротор для Gene Disc 72-луночный или 100-луночный
Ротор для Gene Disc 72-луночный и его фиксирующее кольцо позволяют использовать Gene Dis c 72 , содержащий 72 пробирки объединенные в одну структуру, для высокопроизводительного формата анализа. Для закрывания пробирок в Gene Disc используются не крышки, а наклеиваемая при нагревании прозрачная полимерная пленка. Преимущество пленки состоит в том, что она предотвращает контаминацию, обеспечивая прочное длительное заклеивание. Для дополнительной информации о Gene Disc см соответствующий раздел.
Помимо Gene Disc 72 можно использовать Gene Disc 100, содержащий 100 аналогичных пробирок объединенных в одну структуру с соответствующим ему ротором.
Таблица. Спецификация роторов
Диапазон объемов реакционной смеси
0.2 мл пробирки для ПЦР
0.1 мл стрипованные пробирки и их крышки
0.1 мл Gene-Disc 72
0.03мл Gene-Disc 100
ВНИМАНИЕ: Роторы, предназначенные для прибора Rotor — Gene 6000 не могут быть использованы с прежде выпускаемыми моделями Rotor — Gene 3000 .
Для модели Rotor — Gene 3000 используйте, пожалуйста, роторы из его комплектации.
Элементы прибора и комплектующие
3.1 Распаковка прибора Rotor — Gene
Когда Вы получите прибор Rotor — Gene 6000 , он будет упакован в коробку, содержащую все необходимое для установки и начала работы с прибором. Далее приведен список аксессуаров, поставляемых с прибором. Используйте этот список, чтобы убедится, что все элементы присутствуют.
Вы заметите коробку с аксессуарами, которая находится сверху защитного кожуха из пены.
В этой коробке содержится:
96-ти луночный алюминиевый штатив PN # 3001-009
72-ти луночный алюминиевый штатив PN # 3001-008
36-ти луночный ротор
Фиксирующее кольцо для 36-ти луночного ротора PN # 6001-004
С двух сторон защитного кожуха из пены Вы найдете следующее:
RS -232 серийный кабель
0.2 мл ПЦР-пробирки (в коробке по 1000 шт )
0.1 мл стрипованые ПЦР-пробирки и крышки (в коробке по 1000шт)
Как только Вы извлечете все эти элементы и проверите их, снимите защитный кожух, расположенный сверху Rotor — Gene 6000 . Аккуратно извлеките прибор Rotor — Gene 6000 из коробки и освободите от полиэтиленовой упаковки.
Откройте крышку, двигая ее назад. Внутри Вы найдете 72-х луночный ротор с фиксирующим кольцом.
Rotor-Gene 6000 Real-Time термоциклер
72-х луночный ротор
Фиксирующее кольцо для 72-х луночного ротора
Теперь, когда Вы успешно распаковали Rotor — Gene 6000 , мы можем приступить к инсталляции.
3.2 Дополнительные аксессуары
Следующие принадлежности могут быть использованы при работе
с прибором Rotor — Gene 6000.
Gene — Disc 72-х луночный ротор
для Gene — Disc 72-х ротора
Gene — Disc 72 загрузочный штатив
Gene — Disc 72 корпус
(15 шт в коробке)
Gene — Disc герметизирующая пленка (60 шт в коробке )
Gene — Disc установка для термозапаивания
3.3 Важно: прочтите перед запуском Rotor — Gene
Перед запуском Rotor — Gene 6000 обратите внимание на следующее:
ВНИМАНИЕ: НЕ ПЫТАЙТЕСЬ открыть крышку прибора во время работы (термоциклирования), когда ротор прибора вращается. Если Вы все же сможете открыть крышку и получить доступ к внутренним частям, Вы рискуете соприкоснуться с нагревательным элементом, электропроводящими и быстро движущимися частями прибора. Это опасно для Вас и выведет из строя прибор.
ВНИМАНИЕ : Если Вы экстренно прерываете работу прибора по выполнению ПЦР-анализа, выключив прибор, откройте крышку и дайте камере остыть, иначе Вы рискуете обжечься о горячие части прибора.
ВНИМАНИЕ : Если прибор используется особым образом, не указанным производителем, можно повредить защиту, обеспеченную прибором.
ВНИМАНИЕ : Рекомендуется, чтобы нижняя часть прибора находилась на свободной чистой поверхности, так как такой мусор как бумага может закрыть вентиляционные отверстия и нарушить охлаждение Rotor — Gene 6000 .
Предостережение: Всегда используйте фиксирующее кольцо для ротора. Это предотвратит возможность открывания пробирок во время эксперимента. Иначе, если пробирки откроются или выпадут из лунки ротора, они могут нанести повреждения в реакционной камере.
Если Вы коснетесь Rotor-Gene 6000 во время циклирования, то, поскольку Вы заряжены статическим электричеством, в некоторых случаях Rotor-Gene 6000 может при этом повторно включиться. Однако программное обеспечение повторно запустит Rotor-Gene 6000 и продолжит выполнение программы анализа.
Убедитесь, что программное обеспечение не работает в виртуальном режиме. Нажмите меню Файл и выберите Настройка … Убедитесь, что не стоит галочка, отмечающая опцию виртуальный режим.
Если Настройка… не доступна, это значит, что данная функция была выполнена дистрибьютором, выполнявшим установку и настройку оборудования.
3.3.1 Предупреждающие знаки
ВНИМАНИЕ: Прибор имеет наклейку, в которой указаны напряжение и частота питающей сети и предохранителя. Прибор должен использоваться при этих условиях. На приборе есть два дополнительных значка (черные символы на желтом фоне).
Первый предупреждающий символ — общий символ опасности, расположенный рядом с переключателем напряжения. Перед первым использованием Rotor — Gene 6000 удостоверьтесь, что переключатель установлен в правильное положение (220V — См. параметры прибора).
Внимание: Если Вы меняете положение переключателя напряжения в то время как прибор включен в сеть, это может привести к серьезной поломке прибора Rotor — Gene 6000 .
Не включайте Rotor — Gene 6000 в сеть, если вы переключаете вольтаж. См. раздел «Установка прибора».
Второй предупреждающий знак – знак горячей поверхности, расположенный рядом
с реакционной камерой; его видно при открытой крышке.
4. Установка и обслуживание.
Установка Rotor-Gene 6000 выполняется просто и занимает совсем немного времени.
Не требуется проводить процедуры калибровки прибора для его установки.
4.1 Установка прибора
Установите Rotor — Gene 6000 на относительно ровную поверхность.
Убедитесь, что достаточно свободного места сзади прибора для того, чтобы полностью открыть его крышку, и что Вы без затруднений можете достать до выключателя питания на задней стенке. Должен также быть доступ для выключения шнура питания из розетки при необходимости.
Прежде чем включить Rotor — Gene 6000 проверьте переключатель напряжения на задней панели прибора. Он устанавливается при производстве. Убедитесь, что его установка соответствует напряжению в вашей сети – 220 V. Если установка переключателя не соответствует используемому напряжению, обратитесь к специалисту службы технической поддержки.
ВНИМАНИЕ: Переключение установки выбора напряжения при подключенном к сети приборе может привести к серьезному повреждению прибора.
Таблица. Спецификации прибора
ширина 370 мм (14.6«), глубина 420 мм (16.5«), глубина с открытой крышкой 560 мм (22«), высота 275 (10.8«)
200 – 240 В (50 Гц), 100 – 200 B (60 Гц)
потребляемая мощность 560 Вт (при работе), 8 Вт (в режиме ожидания)
Допустимые температуры транспортировки
Диапазон температуры при работе
Присоедините прилагаемый USB-кабель или RS-232 кабель к USB порту или COM-порту на задней панели компьютера. Подключите USB-кабель или RS-232 кабель к Rotor — Gene 6000 сзади. После этого подключите Rotor — Gene 6000 к источнику питания.
Единственное, что требуется выполнять пользователю, это поддерживать линзы в относительной чистоте и освобождать их от пыли, которая может накапливаться со временем.
Рекомендуется держать крышку прибора закрытой, если он не используется, чтобы минимизировать попадание пыли в камеру.
Заглядывая в термоциклирующую камеру можно заметить в дне камеры округлую линзу, за которой располагаются светоизлучающие светодиоды. Если эта линза покрывается пылью или другими загрязнениями, следует очистить ее, используя хлопковый тампон и этиловый спирт.
На боковой стенке нагревательной камеры также имеется круглая линза. На ней обычно не накапливается пыль, однако, если помещать в камеру влажные или пыльные пробирки, то частицы с них могут попадать при вращении ротора на линзу. Если требуется очистить эту линзу, ротор можно снять, открутив фиксатор в центре. Линзы можно чистить, используя хлопковый тампон и этиловый спирт.
4.3 Установка программного обеспечения
4.3.1 Установка программного обеспечения
Чтобы установить программное обеспечение вставьте компакт-диск с программой Rotor — Gene 6000 в дисковод Вашего компьютера. На диске Вы увидите список опций для пользователя. Выберите опцию установки программы Install Rotor — Gene Software .
Следуйте всем появляющимся инструкциям по установке.
На рабочем столе появится значок программы Rotor — Gene 6000 Series Software 1.7
Таблица. Требования к компьютеру
Microsoft Windows XP
Pentium IV или выше, 2 ГГц
Емкость жесткого диска
После того, как программное обеспечение установлено на компьютер, присоединенный
к Rotor-Gene 6000, включите прибор переключателем включения, находящимся справа на задней стенке корпуса прибора. Появится голубая подсветка светового индикатора Ready, что означает, что прибор готов к работе.
Д важды щелкните по значку программы Rotor — Gene 6000 Series Software 1.7 на рабочем столе, чтобы запустить работу программы, появится экран приветствия Welcome . Это окно появляется только один раз после установки программы. Нужно внести в соответствующие поля информацию о серийном номере прибора и о том, через какой порт он подключен к компьютеру.
Machine Serial Number (Серийный номер): впечатайте серийный номер прибора (шесть цифр), указанный на задней панели его корпуса.
Offset Coefficient : впечатайте значение параметра Offset coefficient, указанное там же сразу после номера прибора, если цифра там не указана, то введите значение 0.
Port (Порт): Выберите, какой порт используется: USB или последовательный COM , если Вы не знаете, какой COM-порт используется, выберите авто-детекцию Auto — Detect .
Exit Program : Выход из программы.
Run in Virtual Mode ( Виртуальный режим ). Если Вы хотите инсталлировать демонстрационную версию программного обеспечения на компьютер, к которому не подключен прибор Rotor-Gene, оставьте эту опцию помеченной при запуске. Программа будет полностью функционально активна и может даже показывать в виртуальном режиме эмулированный анализ в режиме реального времени.
Но чтобы выполнять реальные анализы на приборе, в программе, установленной на его компьютер, не нужно отмечать опцию Run in Virtual Mode , иначе Вам потребуется изменить эту установку в меню Setup .
После установки всех параметров нажмите кнопку Begin . Подождите, пока пройдет инициализация, что может занять несколько секунд. Если бокс в строке Run in Virtual Mode не отмечен, то прибор инициализируется и автоматически откроется программа Rotor — Gene .
Если был выбран виртуальный режим, то на экране появится сообщение:
4.3.2 Версия программного обеспечения
Усовершенствование программного обеспечения для Rotor-Gene происходит постоянно. Чтобы узнать номер Вашей версии, щелкните Help (Помощь) , а затем About Rotor-Gene (Про Rotor-Gene).
Появившаяся картинка на экране представляет общие сведения о программном обеспечении и включает номер версии программного обеспечения, серийный номер термоциклера, а также дату последнего обновления программы.
4.3.3 Обновление программного обеспечения
Обновление программы пользователь может получить на веб-сайте компании Corbett Life Science : http :// www . corbettlifescience . com . Этот адрес можно взять из меню Help программы Rotor-Gene. Обновление программы пользователь получает бесплатно. Нужно зарегистрироваться на сайте, чтобы получить логин и пароль.
4.3.4 Что нового в программе
Здесь описываются новые опции версии 1.7 программы Rotor-Gene 6000 и приводятся ответы на обычно задаваемые вопросы о ранее имевшихся опциях, которые были изменены или перемещены. Эти изменения в программе включают и изменения, запрошенные пользователями.
Кривые плавления с высоким разрешением – HRM ( High Resolution Melts )
Этот анализ позволяет характеризовать образцы ДНК-мишени по длине, GC-составу и более детально характеризовать последовательность ДНК-мишени по ее комплементарности зонду. Генотипирование по полиморфизму единичных нуклеотидов (SNP) – типичное применение данного анализа, при этом его использование позволяет снизить себестоимость тестирования по сравнению с другими применяемыми для этого методами.
Export to LinReg
Теперь стало возможно экспортировать данные напрямую в LinReg. Поскольку LinReg использует данные, нормализованные после количественного анализа, Вам нужно сделать количественный анализ до экспорта.
Новая функция: Шаблоны анализа
Добавлена возможность для импорта и экспорта специфических установок анализа, которые показываются в главном окне анализа. Такие специфические установки анализа как bin и определение генотипов сохраняются в файле и могут быть загружены в другие файлы анализа.
Небольшие улучшения в интерфейсе программы
• В окне выбора формата анализа данных добавлена возможность показа дополнительных типов анализов.
• Добавлены дополнительные статистические функции для сравнительного количественного анализа «Сomparative Quantitation».
• Исправлено изменение размеров окна выбора образцов.
• Расширено окошко отчётов.
• Исправлены границы страниц для отчетов результатов
• Улучшена точность графика температуры во время детекции.
Синхронизированы имена образцов на страницах таблицы образцов
Для мультиплексных анализов, когда используют множественные страницы в таблице образцов, и на этих страницах используют идентичные имена образцов, добавлена опция автоматического обновления (синхронизации) названий и цветовых обозначений образцов.
Интеграция TeeChart Office
Интеграция с TeeChart Office была сделана так, что графики могут быть выбраны для редактирования в TeeChart Office напрямую из программы Rotor-Gene. TeeChart Office можно бесплатно загружать с нашего web-сайт. Этот программное обеспечение даёт возможность изменять стиль линии, добавлять легенду к
графикам и изменять шрифт, как того требуют некоторые публикации.
ID формат для образцов
Теперь возможно переключать формат нумерации образцов в редакторе образцов.
Установка шага температуры для опции “ T ouchdown”
Стало возможным устанавливать значение для шага снижения температуры с каждым следующим повтором цикла от 0.1 до 2 градусов за один шаг
Регулируемые Бины для кривой плавления (Melt Bins)
Введена возможность назначать имена и диапазон температуры, присвоенный для бина. Параметры бина теперь можно редактировать.
Добавлена возможность определения диапазона при автоматической оптимизации параметра усиления “ gain ”
Добавлена возможность определения диапазона значений параметра “gain”, сканируемых во время автоматической оптимизации.
Автоматическая оптимизация параметра усиления « gain » добавлена в шаблон « SYBR Green »
В шаблоне «SYBR Green» предусмотрено проведение автоматической оптимизации параметра «gain» по образцу в первой позиции. Эта процедура может быть задана c использованием мастера Быстрого Старта.
Добавлен шаблон « New Empty Run » («Новый Пустой Шаблон Анализа»)
Был добавлен новый шаблон который можно использовать в Мастере. Этот шаблон не базируется ни на какой специальной химической реакции. Он позволяет задать программу анализа для такого формата реакции который не поддерживается мастером в настоящее время. С помощью этого шаблона можно ввести программу для любого вида анализа.
Улучшение Мастера Быстрого Старта
Добавлена кнопка для сохранения заданных установок в виде нового шаблона.
Добавлена возможность открывать шаблон из другой директории.
5. Подготовка к проведению анализа
Программное обеспечение Rotor-Gene 6000 позволяет легко и удобно проводить Ваши анализы.
5.1 Подготовка пробирок с реакционной смесью
Как было описано в разделе Типы роторов (2.4), в системе Rotor — Gene 6000 доступны для использования 3 типа роторов, каждому из которых соответствует свой тип используемых с ним пробирок. Можно использовать 36-луночный ротор для пробирок объемом 0.2 мл, 72-луночный ротор для пробирок объемом 0.1 мл, стрипованных по 4, или Gene Disc со специальными пробирками объединенными в один модуль, которые запечатываются полимерной пленкой.
Подготовку пробирок с реакционной смесью можно проводить, используя специальные штативы: 96-луночный штатив для пробирок объемом 0.2 мл, 72-луночный штатив для пробирок объемом 0.1 мл, или штатив для Gene Disc. Все штативы сделаны из алюминия и могут быть предварительно охлаждены.
В 72-луночный штативе есть также лунки, позволяющие разместить до 8 пробирок объемом 0.5 мл, которые можно использовать для приготовления мастер-микс, а также 16 пробирок объемом 0.2 мл.
Поставьте пробирки в лунки штатива и внесите нужные компоненты реакционной смеси.
Плотно закройте крышки пробирок и визуально проверьте, что все они хорошо закрыты.
Вставьте пробирки в соответствующий им ротор и убедитесь, что все пробирки находятся в правильном положении в роторе. Если пробирки не до конца входят в ячейки ротора, они будут плохо детектироваться, это приводит к снижению сигнала и чувствительности анализа. Можно воспользоваться специальной подставкой для ротора, чтобы было удобно помещать в него пробирки.
Инновационный роторный дизайн прибора Rotor — Gene 6000 обеспечивает максималь-ную точность и эквивалентность температурного режима для всех пробирок в роторе.
Чтобы достичь максимальной точности температурного режима, заполните все ячейки ротора пробирками, не используемые для анализируемых образцов ячейки заполните пустыми пробирками. Для этого следует иметь некоторое количество пустых пробирок.
Наденьте соответствующее фиксирующее кольцо на ротор, пропустив три пина фиксирующего кольца во внутренние отверстия ротора. Фиксирующее кольцо будет удерживать пробирки в правильном положении во время работы прибора.
Вставьте ротор с реакционными пробирками в камеру прибора Rotor — Gene 6000 , совместив отверстие для фиксации в роторе с фиксирующим пином на штифте и надавив слегка на ротор. Чтобы снять ротор с оси слегка надавите на фиксатор сверху, чтобы он освободил ротор, и потяните ротор вверх.
После того как ротор с фиксирующим кольцом закреплены в камере, закройте крышку прибора и запустите выполнение анализа в программе Rotor — Gene .
Подготовка Gene — Disc
Gene-Disc 72 содержит 72 пробирки, объединенные в одно целое, и может использоваться для повышения пропускной способности методики при достаточно большом количестве анализируемых образцов. Для него не используются крышки, а используется специальная полимерная пленка для термогерметизации. Ее накладывают сверху и запечатывают (заклеивают) с помощью нагревания. Преимущество пленки – в том, что она обеспечивает прочное, длительное запечатывание пробирок, предотвращая возможность контаминации.
Используя специальный штатив для Gene-Disc, можно подготовить реакционные смеси либо вручную, либо использую автоматическую систему CAS 1200. Чтобы поместить Gene-Disc на штатив используйте петлю в первой позиции Gene-Disc. Скользите Gene-Disc по штативу и пробирки попадут в ячейки штатива. Дизайн блока обеспечивает удобное пипетирование.
Достаньте один лист запечатывающей пленки и снимите с нее центральную часть, слегка изогнув пленку в середине, выпятив центральную часть, и аккуратно оторвав ее.
Надпись SIDE UP (Верхняя сторона) обеспечивает правильную ориентацию пленки для ее заклеивания. Проверьте, что эта надпись читается правильно внизу штатива, над рядом лунок для реактивов. Отверстие в центре пленки вместит выступающий цилиндр центральной части штатива и пленка ляжет сверху на Gene-Disc.
Включите аппарат для теплового запечатывания выключателем слева сзади. Загорится красный индикатор Power сверху на аппарате. Необходимо дать аппарату прогреться в течение примерно 10 минут после включения, чтобы он достиг нужной температуры, после чего загорится зеленый индикатор Ready . После этого аппарат можно оставить работающим постоянно, специальный вентилятор воздуха при этом обеспечивает безопасную при прикосновении температуру поверхностей аппарата.
Поместите внутрь Gene-Disc с пленкой в штативе, используя направляющие по бокам штатива. Убедитесь, что штатив полностью помещен внутрь.
Высвободите черный фиксатор на крышке аппарата, чтобы опустить заклеивающий механизм. Для этого надавите вниз синий анодированный бар в верхней передней части ячейки ладонью и надавите на черный фиксатор.
Когда механизм опустится, появится оранжевый индикатор Sealing сверху.
После того, как раздастся звуковой сигнал, надавите на синий анодированный бар, чтобы поднять и зафиксировать заклеивающий механизм в исходном положении. Поднимайте механизм сразу после звукового сигнала, иначе при превышении времени Gene-Disc может деформироваться
Вытащите штатив из аппарата для запечатывания. Дайте остыть пленке примерно 10 секунд, затем оторвите лишнюю, выступающую за края диска часть пленки. Выньте Gene-Disc из штатива. Чтобы поместить Gene-Disc в ротор используйте петлю в первой позиции, чтобы найти нужную ориентацию.
5.3 Включение прибора Rotor-Gene
Rotor — Gene запускается в результате следующей последовательности операций:
1. Включите персональный компьютер и подождите, пока загрузится Windows Х P .
2. Включите Rotor-Gene , нажав кнопку cправа на задней панели прибора и дождитесь загорания индикатора (светодиода) напротив надписи Ready на крышке прибора.
3. Двойным щелчком по ярлыку Rotor-Gene запустите программу.
Теперь Rotor-Gene готов к работе .
6. Запуск анализа (Старт), установка параметров программы теста
Установка параметров и запуск выполнения анализа на приборе RotorGene может быть осуществлен либо при использовании Мастера Быстрого Старта ( Quick Start ) или Детального Мастера Старта ( Advanced ). Для удобства Мастер содержит ряд шаблонов в которых установлены параметры термоциклирования и детектирующие каналы по умолчанию. Вам нужно выбрать подходящий шаблон из списка. Для переключения между видами Мастера используйте кнопки вверху окна Новый запуск ( New Run ).
Как предыдущий ( Perform Last Run ) используются все параметры (профиль термоциклирования, обозначение образцов, детектирование) установленные в последнем из ранее проведенных анализов
Sybr Green ( R ) I : трехступенчатый профиль термоциклирования с кривой плавления и детекцией сигнала на Зеленом (Green) канале
FRET с гашением ( Quenched FRET ): трехступенчатый профиль циклирования с кривой плавления и детекцией сигнала на Зеленом и Желтом каналах (Green и Yellow)
Temperature Calibration Rotor Run : используется с выпускаемым Corbett Оптическим ротором для Верификации Температуры (Corbett’s Optical Temperature Verification)
Измерение концентрации ДНК ( DNA Concentration Measurement ) – это шаблон по умолчанию, используемый для измерения концентрации ДНК с применением инеркали-рующего красителя
Rotor — Gene Demo Kit содержит профили, используемые для Sybr Green ( R ) I и Dual Labeled Probe демонстрационных наборов
Профили циклирования и детектирования могут быть изменены в этой опции за исключением Temperature Calibration Rotor Run и DNA Concentration Measurement
Любой шаблон отредактированный пользователем может быть добавлен в этот список при его сохранении.
6.1 Мастер быстрого старта/ Quick Start Wizard
Выберите вкладку Quick Start ( Быстрый Старт) в окне New Run и выберите шаблон программы анализа . Выберите нужный шаблон для программы анализа из предлагаемого списка Мастера Quick Start (Быстрый Старт) в соответствии с их описанием в предыдущем разделе.
6.1.1 Выбор ротора/ Rotor Selection
В окне Rotor Type (Тип Ротора) выберите нужный тип ротора.
Фиксирующее пробирки кольцо должно быть прикреплено к ротору. Кликните опцию Locking Ring Attached (прикрепление фиксирующего кольца), пометив ее галочкой, и далее следуйте указаниям появляющимся на экране.
Выбранный Вами шаблон импортирует параметры термоциклирования и назначенные для детекции каналы. Изменить эти параметры при необходимости можно, используя Редактор Профиля в Окне Confirm Profile . Подробно редактирование профиля термоциклирования и детекции флуоресцентного сигнала описано в разделе 6.3 Редактирование профиля / Edit Profile .
В этом окне с помощью кнопки Start Run осуществляется запуск выполнения программы анализа прибором.
6.1.3 Сохранение данных анализа ( Save Run )
Файл с данными анализа может быть сохранен по желанию пользователя в любом выбранном месте. Кликнув Save Run , Вы открываете окно Save As и сохраняете данные. Вы можете использовать название которое предлагает программа – с определением даты, используемого шаблона и порядковый номер исследования, проводимого в этот день по данному шаблону. Например, как показано на рисунке, анализ, проводимый первый раз 11 Мая 2004 по выбранному шаблону Sybr Green( R ) I будет сохранен в файле под указанным названием:
6.1.4 Таблица образцов (Edit Samples)
После того как прибор начнет выполнение теста, согласно заданной программе, автоматически откроется окно редактирования таблицы образцов. Введите обозначения (идентификаторы) образцов и другую нужную информацию о них в соответствующие графы таблицы. Подробнее редактирование таблицы образцов описано в разделе 6.5 Редактирование таблицы образцов .
Детальный Мастер Старта / Advanced Wizard Мастер Детальной установки параметров
Выберите вкладку Advan с ed в окне New Run и выберите шаблон запуска анализа . «Детальный» вариант мастера Advan с ed содержит опции которых нет в Мастере Быстрого старта (Quick Start), а именно, такие опции как оптимизация параметра усиления сигнала (gain auto-optimisation) и выбор скорости ротора (Rotor speed). Мастер Advanced wizard последовательно открывает окна, в которых Вы можете задать (отредактировать) необходимые параметры программы анализа. Для перехода к следующему окну мастера используйте кнопку Next >> в нижней части каждого окна. Чтобы вернуться к предыдущему окну используйте кнопку Back .
6.2.1 Первое окно – выбор ротора / Welcome Screen
Открывшийся экран запрашивает информацию о типе используемого ротора. Так же, как и в Мастере Quick Start, Вы должны пометить, что фиксирующее кольцо прикреплено к ротору, поставив галочку в строке Locking Ring Attached . Чтобы продолжить, нажмите кнопку Next >> внизу окна.
6.2.2. Второе окно
В данном окне вы можете обозначить имя пользователя и информацию о выполняемом анализе. Необходимо ввести объем реакционной смеси. Rotor-Gene настроен на объем образцов 20-25 мкл. При использовании больших объемов программное обеспечение рекомендует увеличить длительность «полок» при циклировании.
При использовании 72-луночного ротора нужно определить, какой из трех возможных форматов расположения и нумерации образцов Вы используете, в строке Sample Layout . По умолчанию предлагается вариант нумерации пробирок цифрами 1, 2, 3… (от 1 до 72). Если есть соответствие образцов в стрипах друг другу (по положению в стрипе при использовании 72-луночного штатива), можно использовать формат нумерации 1 A , 1 B , 1 C … Если последовательные (соответствующие друг другу) образцы находятся в каждой восьмой пробирке (при использовании многоканальной пипетки), можно использовать формат A 1, A 2, A 3… Для большинства пользователей достаточно использовать вариант, предложенный по умолчанию.
6.2.3 Третье окно (окно профиля термоциклирования и оптимизации параметра усиления сигнала « gain »)
Этот экран позволяет вносить изменения в температурный профиль Temperature Profile и установки детектируемых каналов Channal Setup . Кликнув кнопку Edit Profile… (редактирование профиля) в верхней половине окна, Вы открываете редактор профиля, позволяющий изменить условия термоциклирования и выбрать детектирующие каналы. Подробно редактирование профиля термоциклирования и детекции флуоресцентного сигнала описано в разделе 6.3 Редактирование профиля / Edit Profile .
Профиль отображается графически в окне Edit Profile . Список блоков, из которых состоит профиль представлен ниже графической схемы. Профиль может состоять из следующих блоков: Hold (удерживание фиксированной температуры), Cycling (циклическое повторение нескольких шагов с разными температурами), Melt (измерение кривой плавления), а также HRM (плавление с высоким разрешением; доступно, если данный прибор имеет соответствующий специальный канал HRM). Установки температуры и времени для каждого блока профиля можно редактировать, кликнув по соответствующему сегменту на графической схеме или по его обозначению в списке. Также можно изменять назначение детекции флуоресцентного сигнала по нужным каналам. Сделав нужные изменения, нажмите кнопку OK .
После установки температурного профиля кликните кнопку Gain Optimisation в нижней половине окна в результате чего откроется окно параметров автоматической калибровки по параметру усиления сигнала «gain» Auto Gain Optimisation Setup . Эта процедура предназначена для автоматической оптимизации параметров детекции флуоресцентного сигнала, с тем, чтобы сигналы от тестируемых образцов находились в нужном диапазоне (не выходили за пределы), она особенно важна, когда Вы в первый раз проводите данный тест. Подробнее см. в разделе 6.4 Автоматическая Оптимизация параметра усиления Gain .
6.2.4 Четвертое окно
Нажав кнопку Next >>, Вы откроете последнее перед стартом окно, в котором перечислены основные параметры программы анализа. В этом окне (справа внизу) находится кнопка Start Run , нажав которую Вы запускаете выполнение программы анализа прибором. При этом откроется окно Save as , в котором Вы вводите имя файла, в котором сохраняются все данные этого анализа, после чего начинается его выполнение. До этого момента необходимо закрепить ротор с образцами с фиксирующим кольцом на оси и закрыть крышку прибора.
После начала выполнения анализа откроется пятое окно – окно редактирования таблицы образцов. Подробно редактирование таблицы образцов описано в разделе 6.5 .
6.3 Редактирование профиля / Edit Profile
Кликнув кнопку Edit Profile … (редактирование профиля) в верхней половине окна,
Вы открываете редактор профилей, позволяющий изменить условия термоциклирования и выбрать детектирующие каналы.
Профиль отображается графически в окне Edit Profile . Список блоков, из которых состоит профиль представлен ниже графической схемы.
Профиль может состоять из следующих блоков: Hold (удерживание фиксированной температуры), Cycling (циклическое повторение нескольких шагов с разными температу-рами), Melt (измерение кривой плавления), а также HRM (плавление с высоким разрешением; доступно, если данный прибор имеет соответствующий специальный канал HRM). Установки температуры и времени для каждого блока профиля можно редактировать, кликнув по соответствующему сегменту на графической схеме или по его обозначению в списке.
Добавить новый блок в программу или удалить ненужный блок можно с помощью следующих кнопок, расположенных справа от окна описания профиля:
Insert after … (Вставить после): позволяет вставить блок непосредственно после выделенного.
Insert befor … (Вставить до): позволяет вставить блок непосредственно перед выделенным.
Remove … (Удалить) : удаляет выбранный блок из профиля
Cycling (блок Циклирования)
Этот блок предназначен для циклического повторения комбинации заданных пользователем шагов с различной температурой/временем, и проведения измерений в заданных точках. Цикл повторяется заданное количество раз. Число повторов задается в строке This cycle repeats X times (Этот цикл повторить X раз) над окном с графи-ческим отображением данного блока циклирования.
Блок циклирования, который выделен, отображается графической схемой в нижней половине окна. В цикле может быть несколько S teps (Шагов), для которых задается своя температура и время удержания. Параметры каждого шага (температуру, время, детекцию флуоресцентного сигнала) можно изменять, выделив его на графической схеме.
Чтобы изменить параметры (температуру или время) шага, щелкните по нему в окне графической схемы цикла, чтобы данный шаг был выделен темным фоном. После этого можно изменять параметры температуры и времени, кликнув по соответствующей кнопке слева от графической схемы и вводя нужные значения в ячейку, а также задавать детекцию флуоресцентного сигнала на данном шаге, щелкнув по кнопке Not Acquiring (Не детектировать) . Вы можете также менять температуру шага, перетаскивая обозначающую ее линию вверх-вниз, и аналогично менять время удержания на заданной температуре, перетаскивая графические линии влево-вправо.
Добавить шаг или удалить шаг из цикла можно с помощью кнопок [+] и [-] в правом верхнем углу окна с графической схемой цикла.
Кроме того, возможно постепенное снижение температуры или удлинение времени определённого шага цикла при повторении их (указываются, если это желательно).
Touchd о wn (Снижение температуры): с помощью этой опции можно задать постепенное снижение температуры данного шага на определенную величину (от 0.1 до 2°С) при каждом следующем повторе цикла в течение нескольких первых шагов (нужное число шагов задается). Это отражается на графической схеме. Обычно эта опция используется для шага отжига.
Long Range (Удлинение): с помощью этой опции можно задать постепенное увеличение длительности выбранного шага на 1 секунду при каждом следующем повторе цикла
в течение нескольких первых шагов (нужное число задается). Обычно опцию используют для увеличения длительности шага элонгации цепи.
Можно назначить детекцию флуоресцентного сигнала по любому каналу на любом шаге (шагах) блока циклирования. Для этого используется кнопка Not Acquiring / Acquiring to… .
Щелкнув по кнопке Not Acquiring (или по кнопке Acquiring to … , если для данного шага уже была ранее назначена детекция), Вы откроете окно Acquisition – окно каналов детекции. В левой части окна представлен список всех каналов, которые можно использовать для детекции ( Available Channells ). Справа – список назначенных для детекции каналов ( Acquiring Channells ). Чтобы назначить детекцию по каналу, переместите его название из левого списка в правый список Acquiring Channells с помощью кнопки стрелки (между списками). Чтобы отменить детекцию по каналу, соответственно, из правого списка переместите его в левый с помощью кнопки . Чтобы отменить детекцию по всем каналам на данном шаге (очистить список) нажмите кнопку или кнопку Don ` t Acquire .
Таблица Dye Channel Selection Chart (Таблица выбора каналов для флуорофоров) в этом окне помогает пользователю правильно выбрать канал, который нужно использовать для детекции сигнала определенного флуорофора. В этой таблице представлены флуорофоры, широко применяемые пользователями, но этот список отнюдь не исчерпывает все флуорофоры, которые можно детектировать при использовании Rotor-Gene.
Если для детекции назначены более одного блока циклирования, то данные, полученные в последующем блоке, могут быть соединены с данными, полученными в предыдущем блоке циклирования. Для этого можно воспользоваться опцией Same as Previous (вверху окна) с ниспадающим списком других блоков циклирования в профиле.
Описанные здесь опции для детекции применяются аналогичным образом и для блока Melt (Плавление), за исключением возможности объединять два графика вместе.
Hold (Удерживание температуры)
Этот цикл дает команду прибору Rotor-Gene оставаться при определенной температуре в течение заданного времени. Выведя значения на экран щелчком этой кнопки, параметры в соответствующих ячейках можно изменить. Появится отдельный экран, в котором вы можете ввести значение в текстовую ячейку или установить его скользящим бегунком.
При использовании опции Оптической денатурации, можно выбрать, какой блок Hold используется для калибровки. По умолчанию для этого назначен первый Hold в профиле, но это можно изменить, если, например, используется сначала Hold на 60°С, а затем Hold на 95°С. Подробнее об опции оптической денатурации см. в разделе Оптическая Денатурация при циклировании.
Melt / Hybridisation (Плавление / Гибридизация)
Для цикла плавления определите начальную температуру, окончательную температуру, время ожидания до первой точки измерения, время удерживания в каждой точке, и с каким Приращением Rising by , т.е. на сколько градусов (от 0.1°С до 1°С) будет произведен постепенный переход между двумя температурами. Опция Acquiring To (Детектировать по), установленная здесь для Melt А , может быть изменена после щелчка по этой кнопке. Появится тот же экран, что и при установке параметров детекции для блока циклирования ( Cycling ), где можно выбрать канал для детекции флуоресценции.
Если стартовая температура выше, чем конечная, т.е. проводится снижение температуры с детекцией, то название этого блока в профиле автоматически изменится на Hybridisation .
С тандартно при измерении кривой плавления используется повышение температуры приростами в 1º и с удерживанием на каждом шаге по 5 сек. С помощью Rotor — Gene 6000 можно проводить плавление с минимальным шагом температуры 0.02. При этом минимальное необходимое время удерживания на каждой температуре зависит от того, какой шаг увеличения температуры используется.
High Resolution Melts (Плавление с высоким разрешением)
Плавление с высоким разрешением процедура в принципе аналогичная процедуре Melt (Плавление), и аналогичным образом редактируется температурный профиль для нее. Отличие процедуры Плавление с высоким разрешением состоит в том, что для детекции используется только специальный канал HRM . Именно за счет использования этого специального канала получается снизить количество шумов и значительно увеличить разрешение получаемой кривой плавления.
Далее, для блока HRM можно проводить процедуру оптимизации параметра «gain» непосредственно перед началом выполнения блока HRM . Параметр «gain» при этом оптимизируется так, чтобы получать максимальные возможные значения флуоресцентного сигнала от данных пробирок, не достигая при этом насыщения 100 Fl (т.е. не превышая верхнего предела шкалы). Этим обеспечивается наилучший режим для получения наиболее точной кривой плавления на всех ее участках. Эта опция включена по умолчанию, пользователю нужно только выбрать, по какой из пробирок будет проводиться оптимизация.
Процедура HRM позволяет затем использовать дополнительные опции при анализе данных, используя в меню анализа раздел High Resolution Melt Analysis (Анализ кривых плавления с высоким разрешением). Эти возможности доступны только тем пользова-телям, которые работают с прибором, поддерживающим HRM.
О птическая денатурация при циклировании ( Optical Denature Cycling )
Оптическая денатурация при циклировании – принципиально новая функция, имеющаяся только у приборов Rotor — Gene , которая позволяет проводить анализ плавления референс-образца в режиме реального времени и в соответствии с этим выбирать динамически температуру денатурации в ходе циклирования. Данная функция предназначена, чтобы оптимизировать условия денатурации для данного типа реакции и снизить время, требуемое для проведения анализа.
Для проведения этой процедуры просто поместите пробирку с заранее амплифицированным продуктом данной реакции в позицию 1 в роторе.
В этой пробирке также должен содержаться реагент, используемые для детекции денатурации ДНК . Мы предлагаем использовать для этой процедуры краситель SybrGreen I .
При первом нагревании до температуры денатурации для этой пробирки измеряется кривая плавления в диапазоне от 80 до 95ºС (можно изменять этот диапазон). Определяется Пик Кривой Плавления Melt Peak и соответствующий ему пороговый уровень флуоресценции референс-образца Порог Денатурации Denaure Threshold . Затем на шаге оптической денатурации каждый раз измеряется флуоресценция референс-пробирки и как только она снижается ниже указанного порогового уровня, прибор начинает выполнять охлаждение до температуры отжига (т.е. переходит от шага денатурации к следующему шагу в профиле).
В процессе циклирования пик не определяется, а фиксируется, когда флуоресценция референсной пробирки достигнет соответствующего этому пику уровня (порога). На рисунке ниже показана исходная кривая плавления и ее первая производная совмещенные на одном графике. Рисунок иллюстрирует соответствие между Порогом Денатурации (Denaure Threshold) и Пиком плавления (Melt Peak), полученными в ходе такой калибровки.
Чтобы проводить оптическую денатурацию нужно:
Поместить предварительно амплифицированный образец в первую позицию в роторе. Этот образец должен содержать продукт амплификации, тот же, какой получается в образцах при проведении этого анализа, и интеркалирующий краситель, позволяющий детектировать денатурацию продукта, например, SYBR Green.
З апрограммировать соответствующий профиль, где включено использование опции оптической денатурации
Информация об установленных параметрах проведения оптической денатурации появится слева от окна с графическим изображением цикла .
Для выполнения данной функции Вам нужно войти в Edit Profile (Редактор профиля) и, выделив первый шаг в цикле ( предназначенном для денатурации ), выбрать тип шага Optical Denature (вместо Timed Step ) в левой части данного окна. Ниже этой строки в графе перечислены параметры калибровки для этой процедуры Calibration Settings , заданные по умолчанию (нагревание до 95ºС . Нажав кнопку Edit (Редактировать) Вы можете изменить эти значения (например, увеличить конечную температуру).
При подготовке нового анализа с реакциями, которые ранее не ставились в приборе Rotor — Gene 6000 , полезно использовать функцию оптимизации параметра Gain (Усиление) . Эта опция позволит Вам установить значения Gain для каждого из каналов и установить температуру оптимизации.
Параметр Gain для каждого канала может изменяться от -10 до 10.
Установки параметра Gain (Усиление) задаются при запуске анализа и заданные значения используются для всех данных по этому каналу измеряемых в данном анализе.
При постановке реакции в первый раз рекомендуется подготовить пробный образец, содержащий все компоненты реакции. Этот образец помещают в прибор и запускают оптимизацию G ain , чтобы получить наилучшие установки параметра Gain .
Gain Auto-Optimisation (Авто-оптимизация параметра «gain»)
Это окно позволит Вам провести автоматическую оптимизацию параметров детекции прибора для данного анализа путём автоматического подбора установок параметра G ain (Усиление) таким образом, чтобы измерения по всем избранным каналам не превышали определенного порога (предела измерения). Это окно можно открыть нажав кнопку Gain Optimis ation (Оптимизация параметра « gain ») в нижней части окна Channel Setup Мастера Старта ( New Run Wizard ) .
Optimise All / Optimise Acquiring ( Калибровать все / Калибровать Детектирующие). Выбор кнопки Optimise All (Калибровать все) приводит к попытке откалибровать все каналы, известные программе. При нажатии кнопки Optimise Acquiring (Калибровать Детектирующие ) будут калиброваться только те каналы, которые Вы использовали для детекции в выполняемом температурном профиле (при циклировании или при плавлении).
Channel Settings (Установки каналов): Это ниспадающее меню, позволяет Вам добавить дополнительные каналы в окно оптимизации G ain . Выберите интересующий Вас канал и нажмите кнопку Add (Добавить) (справа в вертикальном ряду кнопок в данном окне) .
Edit ( Редактировать): Эта кнопка открывает диалоговое окно, где устанавливается диапазон, в котором должен находиться флуоресцентный сигнал пробирки по которой проводится оптимизация ( Target Sample Range ) , и позицию в роторе пробирки, по которой проводится оптимизация ( Tube Position ). Процесс автоматической оптимизации состоит в проведении постепенного перебора значений параметра «Gain» и считывания флуоресценции. При этом выбирается первое значение G ain , при котором получен флуоресцентный сигнал, попадающий в заданный диапазон. В приведенном ниже примере была выбрана позиция пробирки 1 и диапазон флуоресцентного сигнала образца от 5 до 10 Fl .
Remove (Удалить) и Remove all (Удалить Все) : Удаляет выделенные цветом каналы или все каналы.
Start (Старт) : Начинает процесс оптимизации. Будет выбрано значение «gain», при котором флуоресцентный сигнал находится в заданном диапазоне. Если ни одно значение, удовлетворяющее этому условию, не найдено, то будет выбрано наиболее подходящее из ближайших значений.
Perform Optimisation Before 1 st Acquisition (Выполнять оптимизацию перед первым измерением) : Пометка в данной ячейке позволяет провести оптимизацию параметра G ain в ходе первого цикла, когда начинается измерение флуоресцентных данных. Этот вариант очень удобен, поскольку в некоторых образцах после первичной денатурации может существенно изменяться фон флуоресценции.
Perform Optimisation At [ x ] Degrees At Beginning of Run (Выполнять Оптимизацию при Х С в начале выполнения анализа): Пометка в этой ячейке позволяет провести оптимизацию параметра G ain непосредственно перед началом выполнения программы анализа. Камера прибора нагревается до заданной температуры, проводится оптимизация по параметру Gain, и затем начинается термоциклирование по заданной программе, начиная с первого шага (обычно это шаг денатурации). Это может быть полезно, если оптимизация в течение первого цикла слишком влияет на длительность удерживания на температуре первого шага программы. Однако обычно оптимальным является использование варианта Perform Calibration Before 1 st Acquisition (Выполнить оптимизацию перед первым измерением) поскольку оптимизация происходит при условиях максимально близких к условиям дальнейших измерений сигнала в ходе анализа .
Изменение G ain в ходе работы : Если в начале выполнения анализа был случайно выбран слишком высокий или слишком низкий Gain то его можно изменить в течение первых десяти циклов. На главном экране появится вертикальная линия там, где Gain был изменен. Вследствие изменения уровня флуоресценции циклы, предшествующие изменению, будут исключены из анализа.
Хорошими диапазонами для начального уровня флуоресцентного сигнала являются следующие:
для SYBR Green – от 1 до 3;
для флуоресцентно-меченых зондов (таких как «TaqMan» или «Beacon») – от 5 до 10;
для системы формата «FRET-гашение» – от 70 до 80.
Установка параметра «gain» вручную
При нажатии кнопки Manual (Ручная) в окне Auto — Gain Optimis ation открывается окно Manual Gain Adjustment (Ручная регулировка параметра « gain ») , которое позволит Вам в реальном времени просмотреть уровень флуоресцентного сигнала при любой заданной температуре. Оно применяется, когда неизвестен фон образца и, соответственно, параметр « gain » необходимо установить так, чтобы сигнал образца был достаточным для детекции и не превышал предела шкалы.
По умолчанию выводятся на экран графики всех образцов. Можно выбрать нужные образцы с помощью меню выбора (включения/выключения) образцов, расположенного справа от окна графиков, как это делается и в других окнах программы.
Требуется примерно 4 секунды для получения данных с одного канала. В течение этого времени интерфейс пользователя не активен, поэтому оптимальная последова-тельность действий такова:
1). Начать тестирование.
2). Дождаться стабилизации температуры.
3). Зарегистрировать флуоресцентный сигнал в конечной точке.
4) Остановить прибор.
5) Внести соответствующие изменения параметра Gain .
6) Снова запустить прибор.
Температура ( Temperature ): Измените это значение, чтобы установить температуру прибора. Примечание: Температура не регулируется во время выполнения прибором заданной операции. Чтобы изменить устанавливаемую температуру, нужно будет заново запустить выполнение процедуры после того, как Вы установите требуемую температуру в соответствующем боксе (Temperature) на экране.
Edit Gains (Редактировать параметр « gain »): Открывает окно Редактирования значений Gain .
Start (Старт) : Запускает работу прибора, устанавливая температуру в соответствии с той, которая указана на экране. Появятся графики температуры и флуоресценции по заданным каналам.
Stop (Стоп) : Останавливает работу прибора. Если прибор все еще получает новые данные, когда Вы нажимаете на эту кнопку, то сначала он завершит получение данных, а затем остановится. Этот процесс может потребовать до 5 секунд для каждого канала.
ПРИМЕЧАНИЕ. Цель установки параметра Gain – получить все данные в правильном диапазоне. Gain не влияет на Ваши данные. Если был выбран очень высокий Gain , то кривые могут выйти за пределы шкалы и данные будут потеряны. Поэтому разумно начинать измерения образцов с Sybr Green I или с двойной меткой при низком уровне флуоресценции (поскольку ожидается прирост), а для образцов в которых используется FRET-гашение – при более высоком уровне флуоресценции (ожидается снижение).
Редактирование таблицы образцов ( Edit Samples )
Это окно функционально идентично редактору таблицы образцов в Мастере Старта. Доступ к этому меню также можно получить, щелкнув кнопку Edit samples под цветной таблицей образцов справа (или после щелчка правой кнопкой мыши по этой цветной таблице образцов).
В данном окне Вы вводите данные по всем анализируемым образцам: положение пробирки в роторе, название и тип образца, а также задаете цвет, которым будут обозначены графики данных для данного образца.
В верхней части экрана даются 3 опции меню: File (Файл) , Edit (Редактировать) и Help (Помощь). Меню Файл позволяет создать новый лист образцов, открыть существующий шаблон образцов или сохранить названия в качестве шаблона для дальнейшего использования. Расширение этих файлов *.smp .
Given concentration format (Формат заданной концентрации): Это падающее меню используется для выбора числового формата, в котором будут определяться концентрации. В связи с тем, что в разных странах форматы обозначают различным образом, для выбора даны разные форматы.
Unit (Единицы): Это падающее меню позволяет выбрать соответствующие единицы (для определения концентрации стандартов) для Вашего анализа.
Edit (Редактировать): Нажатие этой кнопки открывает цветную схему. Избранные образцы (вплоть до 36 или 72 ) будут изменены в соответствии с выбранным цветом. Щелкните ОК и всем избранным образцам будет присвоен этот цвет.
Reset Default (Переустановка по умолчанию): Щелкните по этой кнопке, чтобы вернуть всем ячейкам их цвет, заданный ранее по умолчанию
Gradient (Градиент): Функция градиента позволяет выбрать градиент от первого к последнему избранному цвету. При установке образцов могут быть выбраны несколько градиентов.
New (Новый ): Очищает таблицу образцов и подготавливает к введению данных.
Open (Открыть) : Выводит диалоговую ячейку, в которой Вы можете выбрать файл образцов Rotor-Gene для импорта.
Примечание . Установки для 36-луночных наборов образцов не могут быть импортированы в 72-луночные установки и наоборот. Число образцов в открытом листе и импортируемый файл должны совпадать .
Save As (Сохранить как ): Выводит диалоговую ячейку, в которую Вы можете ввести название файла для сохранения текущих образцов.
Copy (Копировать): Копирует избранные ячейки.
Paste (Склеить): Склеивает ячейки, которые были выбраны командой копировать по отношению к избранной текущей позиции на сетке.
Excel : При нажатии данной кнопки возникает подсказка для введения названия файла. Затем автоматически открывается Excel .
Тип образца указывается в графе Type . Существует несколько типов образцов, которые перечислены ниже:
Unknown (Неизвестный образец): Для неизвестных образцов, которые подлежат количественному анализу или анализу с помощью кривых плавления
Standard (Стандарт): Образцы с известной концентрацией, значения концентраций стандартов используются для построения кривой стандартов и расчета концентраций неизвестных образцов
None (Никакой): Нет образца в этой позиции
NTC (No Template Control): Негативный контроль без матрицы ДНК
Sa mple Pages ( C траницы в таблице образцов): Эта опция позволяет пользователю по разному определять одни и те же образцы в разных страницах таблицы. Пользуйтесь кнопками со стрелками для передвижения от одной страницы к другой. Программа позволяет создать новую страницу кнопкой New и удалить ненужную кнопкой Delete . Странице можно присвоить имя.
Эта опция полезна, когда при анализе необходимо получить несколько кривых стандартов, измеренных либо на одном канале (например, Sybr Green I или любой другой флуорофор) либо наоборот, на нескольких каналах (используя до 4 различных флуорофоров).
Given Conc (Заданная Концентрация): Показывает концентрацию для каждого из определенных стандартов. Единицы измерения могут определяться как десятичные или логарифмические. Если надо впечатать серии разведений, то необходимо ввести только первые два стандарта. После нажатия Enter программа автоматически добавляет 10 -кратную концентрацию, если ниже определены дальнейшие стандарты.
Дополнительные опции (для повышения оперативности ввода данных):
Автозаполнение : При введении стандартов, если Вы помещаете их в последо-вательных пробирках, начните ввод данных с первой пробирки, затем нажмите Ввод. Введите вторую концентрацию и нажмите Ввод. Программа автоматически спрогнозирует следующую концентрацию в ряду. Удерживайте нажатую клавишу ввода для заполнения оставшихся рядов.
Ввод множества рядов: Если Вам нужно ввести сходную информацию для нескольких рядов сразу, выберите все ряды, затем начните вбивать значения. Информация будет введена в каждый ряд. Эта функция работает для выбора типа образцов, цветов или введения концентраций.
Клавиша Быстрого Ввода Типа Образцов : Чтобы быстро выбрать тип образцов, введите только первую букву её названия. Так, чтобы установить формат 5 образцов как NTC, выберите их в столбце типа образцов, затем нажмите N . Все образцы будут конвертированы в NTC .
Полное описание образцов может быть сохранено как файл последовательности образцов (*.smp) и может загружаться в последующие анализы с той же конфигурацией образцов.
Примечание: вся последовательность образцов может быть отдельно сохранена в виде файла с расширением *. smp и загружена в следующие файлы анализа с такими же образцами.
Роторный вид Редактора Образцов – это альтернативная форма редактора образцов в виде графического изображения ротора с обозначенными на нем точками образцами. Он подходит для быстрого редактирования, когда не нужно вводить дополнительную информацию помимо названий (идентификаторов) образцов и их цветового обозначения. Подробная информация о образцах может быть введена с использованием стандартного формата редактора.
Задав произвольную группу образцов, Вы можете рассчитывать статистические параметры внутри этой группы. В отличие от реплик, которые должны иметь одинаковое обозначение (название) образца, образцы группы могут иметь любые имена и располагаться в любых позициях в роторе, а также входить в другие группы. Чтобы определить группу, введите имя группы в ячейку рядом с типом образца и нажмите Enter .
Автоматически появится окно названия группы
Введите подходящее обозначение и нажмите ОК. Это обозначение можно использовать, чтобы формировать группу образцов. Для группы автоматически рассчитываются общие параметры, такие как среднее значение и 95% доверительный интервал.
7. Обзор основных функций
Данная глава поможет ознакомиться с элементами интерфейса Rotor-Gene .
7.1. Рабочее пространство
Рабочее пространство программы Rotor-Gene занимает большую часть основного окна. Это область, в которой Вы можете открыть графики необработанных данных, температуры и результатов анализа. Если во время работы у Вас открыто несколько окон одновременно, Вы можете организовать их расположение, щёлкнув по кнопке Arrange (Размещение) в меню программных инструментов. Существует несколько доступных дополнительных опций, которыми Вы можете воспользоваться, щёлкнув по значку « Стрелка Вниз », который появляется рядом с указанной кнопкой.
7.2. Панель инструментов
Эти кнопки обеспечивают быстрое выполнение наиболее часто используемых операций. Чтобы увидеть, какова их функция, задержите курсор мыши поверх клавиши, после этого появится краткое объяснение. Доступ к этим командам также может быть осуществлен через соответствующие пункты основного меню с теми же наименованиями.
New (Новый) — создать новый файл
Open (Открыть) – открыть файл
Save (Сохранить) – сохранить файл
Start (Старт) – запуск программы
Pause (Пауза) – временное прерывание (пауза) выполнения программы
Stop (Стоп) – стоп
Help (Помощь) – помощь
View (Обзор) – обзор
Exp . Info (Эксп. Информация) – информация об анализе
Progress (Прогресс) — ход процесса
Profile (Профиль) – профиль термоциклирования и детекции
Temperature (Температура) – температура
Samples (Образцы) – таблица образцов
Arrange (Упорядочить) – упорядочивание открытых окон
7.3. Обзор необработанных данных различных каналов
Щёлкните по этим кнопкам, чтобы увидеть данные различных каналов в открытом файле анализа.
При просмотре данных канала можно использовать различные опции для изменения представления данных. Можно трансформировать данные для выполнения каких-либо редко используемых вариантов анализа данных.
A djust Scale (Настройка Масштаба Шкалы): выведет окно, в котором Вы сможете ввести масштаб вручную или выбрать его автоматически. Чтобы выбрать эту опцию, просто нажмите правую кнопку мыши над соответствующим экраном.
Auto-Scale (Авто-Масштаб): автоматически приводит шкалу в соответствие с максимальными и минимальными считываемыми данными.
Default (По умолчанию): установит масштаб от 0 до 100 флуоресцентных единиц.
Символ гаечный ключ
Щ елкая по изображению гаечного ключа, Вы получаете доступ к набору инструментов, упрощающих ручной анализ данных. Доступ к этим инструментам также может быть осуществлен при нажатии правой кнопки мыши в соответствующих экранах.
7.4 Включение / выключение образцов
Используйте данное средство управления, чтобы скрыть или показать различные образцы на экране. Высветленные образцы выключены (не выбраны). Панель Развёртки (Прокручивания) используется для вывода на экран следующих групп образцов. Вы можете просматривать образцы по отдельности, щёлкая по ним курсором мыши, или Вы можете скрыть/показать все образцы, входящие в часть таблицы образцов, которая видна на экране (их количество зависит от пространства экрана), щёлкнув по кнопке Bank on / Bank off (включить/выключить группу) . Чтобы выбрать ряд образцов, щёлкните курсором мыши на первом образце и протащите мышь до последнего выбираемого. Когда Вы отпустите кнопку мыши, то выбранные образцы будут либо выделены, либо выключены. Щёлкнув по кнопке Named On (Включить именованные) , Вы сможете увидеть только те образцы, которым Вы присвоили имя; это быстрый способ показать только отдельные необходимые образцы. Щёлкая по кнопке All On / All Off (Все включены / Все выключены), Вы можете увидеть / вылючить все 36 или 72 образца. Нажатие на кнопку Edit Samples (Редактировать образцы) открывает окно редактирования таблицы образцов.
Вывод образцов на экран — если используется 72-луночный ротор , то образцы показываются от А1 до А8 , от В1 до В8 и т.д. Использование кнопки вывода иденти-фикаторов образцов на экран позволяет пользователю переключиться на формат таблицы образцов, при котором указывается порядковый номер образца в роторе от 1 до 72 .
Select Groups (Выбрать группы): Если в таблице образцов (в окне Edit Samples ) были определены группы, то эта опция позволит выводить на экран отдельно группу образцов из активизированной страницы. Группа – это произвольно объединенное множество образцов, при объединении которых можно получить дополнительные отчеты по статистическим результатам. Например, можно определить группу образцов от пациентов, получавших терапию, и группу образцов от не проходивших лечение пациентов
7.5 Меню Файлов / File
При выборе в меню New открывается окно New Run . Это окно предоставляет Вам возможность воспользоваться широко используемыми шаблонами, собранными в списке шаблонов Мастера Быстрого Старта Quick Start или Детального Мастера Старта Advanced . После выбора Мастера, его последовательно открывающиеся окна проведут пользователя по всем параметрам, которые нужно определить, чтобы запрограммировать выполнение определенного вида анализа. Информация о шаблонах представлена в разделах «Мастер Быстрого Старта» и «Детальный Мастер Старта» (Глава 6).
Активные кнопки окна New Run :
New : запускает Мастер для создания программы анализа на основе выбранного шаблона.
Cancel (Отменить): Закрывает это окно.
Help (Помощь): Открывает окно помощи.
Show this screen when software opens : Если эта опция отмечена галочкой, то окно New для запуска нового анализа будет автоматически открываться, когда открывается программа Rotor — Gene .
Опции Открыть файл, сохранить файл / Open , Save as
При обращении к меню File становятся доступными перечисленные ниже опции.
Open . (Открыть): Позволяет открыть ранее сохраненный файл с данными анализа Run File (.rex) или архивный файл Run Archive (.rea file).
Open Recent . (Открыть последние…): Показывает список последних четырех файлов, которые открывали или сохраняли
Save (Сохранить): Сохраняет файл с внесенными в него изменениями
Save As . (Сохранить как…): Позволяет сохранять файл в различных форматах, например, как шаблон для последующих запусков анализа. Возможные форматы следующие:
Run File . (Файл данных анализа): Сохраняет копию данного файла. Можно изменить имя или директорию, в которой сохраняется файл. Этот формат выбирается по умолчанию.
Template . (Шаблон): Сохраняет файл, как шаблон для последующих запусков такого же анализа, с заданным профилем термоциклирования и детекции и некоторыми другими установками, но без данных анализа.
Run Archive . (Архивный файл): Сохраняет в наиболее компактном формате. Следует сохранять в таком формате файлы, которые Вы хотите отправить по E-mail. Это упростить пересылку файла и защитит его.
Excel Data Sheet . ( Excel Лист Данных): Экспортирует все необработанные данные по всем каналам в лист Excel. При этом экспортируются данные только выделенных образцов.
Excel Analysis Sheet . ( Excel Лист Анализированных Данных): Экспортирует все данные анализа в один лист Excel.
LinReg Export Format . (Экспорт в формат LinReg ): Экспортирует все необработанные данные в формат распознаваемый программой LinReg. См. раздел «Экспорт в LinReg» для получения дополнительной информации.
Matlab Export . – Экспорт в формат, распознаваемый пакетом научных программ Matlab (или его эквивалент в свободном доступе, Octave ). Эта опция полезна для научных исследований.
Экспорт в формат LinReg / LinReg Export Format
Программа LinReg – это приложение, разработанное авторами публикации: «Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data.»
Ramakers C, Ruijter JM, Deprez RH, Moorman AF. Neurosci Lett. 2003 Mar 13;339(1):62-6.
Краткое содержание статью можно найти по адресу: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=12618301&dopt=Abstract
Чтобы импортировать в формат LinReg данные из программы Rotor-Gene откройте файл с данными, выполните выбор опции Save As . затем LinReg Export Format как показано на рисунке.
Опция Reports . (Отчеты)
Опция Reports. загружает окно формирования отчетов. Если данные ранее уже были проанализированы, то можно вывести отчет о результатах непосредственно через данную опцию, не обращаясь вновь к модулю анализа. Можно получать разные формы Отчетов, содержащих более или менее подробную информацию.
Опция Setup . (Установки)
Установки программы задаются пользователем в процессе ее инсталляции. Однако после этого Вы можете изменить их с помощью данного окна Setup
Virtual Mode (Виртуальный режим) : отметьте галочкой эту опцию, если программа будет использоваться без подключения прибора Rotor — Gene для анализа данных, создания шаблонов или демонстрации. Все функции программы будут активны.
Port (Порт): Выберите правильно, какой последовательный ( COM ) порт используется. Если Вы не уверены, какой порт выбрать, используйте автодетекцию Auto — Detect .
Allow access to this screen (Сохранить возможность доступа к этому экрану): Если не отметить галочкой эту опцию, то впоследствии Вы не сможете обращаться к этому окну. Чтобы восстановить доступ нужно будет обратиться к дистрибьютеру.
8. Меню Анализа данных / Analysis
8.1 Панель инструментов меню Analysis (Анализ).
Выбор меню Analysis в главной панели инструментов открывает окно панели инструментов меню анализа данных.
Эта панель инструментов позволяет Вам провести новый анализ, выбрав его формат, или вывести на экран уже существующие результаты. Кнопки вверху окна позволяют Вам выбрать метод проведения анализа. Как только Вы выбрали метод, ниже перечисляется список каналов, которые могут быть проанализированы данным методом. Рядом с теми каналами, данные которых уже были ранее проанализированы, появится зелёная отметка (галочка). Это означает, что для данного анализа сохранены в памяти установки уровня порога и нормализации. Чтобы проанализировать данные канала или включить обзор данных канала, щелкните дважды по его названию. После этого откроется специальное окно анализа.
Auto — shrink Window (Авто-сворачивание окна) – отметка в данной графе означает сворачивание окна, если оно не используется. Перемещение курсора над окном вновь разворачивает его.
Организация Вашего рабочего пространства ( Arrange ) – всякий раз, когда Вы двойным щелчком мыши начинает новый анализ, окно будет организовано в соответствии с тем видом, которое уже выведено на экран. Эту функцию сложно использовать, когда открыто много окон. Просто закройте те окна, которые Вам не нужны, затем нажмите на панели кнопку Arrange (Организовать). Данное окно будет автоматически реорганизовано в соответствии с методом «Smart Tiling» (Умное управление окнами). Вы можете выбрать другой метод организации, щёлкнув по значку стрелки вниз рядом с кнопкой Arrange панели инструментов.
Щелчок правой кнопкой мыши по окну анализа также позволяет «Показать» ( Show ) , «Скрыть» ( Hide ) или «Удалить Анализ» ( Remove ).
8.2 Количественный анализ – Quantitation Analysis
Выбрав меню Analysi s , щёлкните дважды по кнопке Quantitation (Количественный Анализ) или нажмите кнопки Quantitation и Show (Показать) , чтобы открыть анализ данных интересующего Вас канала. Автоматически могут быть открыты сразу три окна: основное окно Quantitation Analysis , окно Standardt Curve (Кривая Стандартов) и окно Quant. Results (Таблица результатов) . В основном окне в панели инструментов слева направо имеются следующие кнопки: Reports (Отчет), Std Curve ( Кривая Стандартов ), Results (Результаты), Dynamic Tube (Динамический фон пробирки), Slope Correct (Корректировка наклона кривой), Ignore First (Игнорировать первые циклы) и Outlier Removal (Удаление Выбросов), использование которых рассмотрим далее.
Основное окно количественного анализа
В этом окне показаны кривые амплификации (кривые флуоресценции) после соответствующей обработки данных (определяется средний фон флуоресценции для каждого образца, производится вычитание фона и нормализация данных, которые затем конвертируются в логарифмическую шкалу).
Детально обработка данных определяется с помощью опций, представленных в меню основного окна (над графиками).
По графикам кривых амплификации в логарифмическом масштабе, которые Вы увидите, как только откроете окно количественного анализа, можно определить нужный уровень пороговой линии и, установив ее, определить значение Ct (порогового цикла) для каждого образца. Значение Ct определяется как цикл на котором кривая флуоресценции данного образца пересекает пороговую линию, оно характеризует начало логарифмической фазы амплификации. Это значение Ct при соответствующем уровне порога напрямую соответствует стартовой концентрации ДНК-мишени в образце (значение Ct пропорционально логарифму стартовой концентрации).
Нажатие кнопки Linear Scale (Линейная Шкала) внизу экрана переведёт из Логариф-мической Шкалы к Линейной Шкале. Обратно к логарифмической шкале можно переключиться снова щелкнув по той же кнопке с названием Log Scale ( Логарифмическая Шкала)
Различие между Линейной и Логарифми-ческой Шкалой заключается только в способе графического представления данных, но не в расчетах. Логарифмическая Шкала визуально увеличивает участок графиков, соответствую-щий началу логарифмической фазы амплификации (вблизи нуля). Линейная Шкала представляет те же нормализованные данные. Это можно легко проверить, включив точечный указатель (опция Show Pinpointer ) на обоих графиках и сравнив полученные значения флуоресценции. Можно увидеть, что между фактическими данными нет различий.
ПРИМЕЧАНИЕ. Эти процедуры можно осуществить во время работы Ротор-Джин. Такой мониторинг количественных данных в режиме реального времени обеспечивает пользователю возможность получения результатов сразу, как только начинает определяться экспоненциальный рост кривых. Можно сразу сделать предварительные заключения и принять решения, касающиеся следующего эксперимента.
Reports (Отчёты) : Открывает окно выбора количественных отчётов, где Вы можете выбрать отчёт для предварительного просмотра избранного количественного анализа. Существуют три различные опции: Standard Report (Стандартный отчёт), Full Report (Полный отчёт) и Concise Report (Краткий отчёт) .
С помощью кнопок, расположенных вверху, отчёт может быть Распечатан (Print) , Сохранен (Save) , Отправлен по электронной почте (Email) или экспортирован в Word ( To Word) .
Кривая Стандартов / Standard curve
Std . Curve (Станд. Кривая): Эта кнопка открывает график кривой стандартов, на основании которого выполнен расчет концентраций ДНК-мишени в образцах. По умолчанию это окно открывается при выполнении количественного анализа. Если Вы закроете данное окно, оно может быть повторно открыто с использованием этой кнопки в основном окне количественного анализа.
Значения параметров кривой стандартов пересчитываются в динамическом режиме, если изменять уровень пороговой линии (с помощью щелчка по ней и перетаскивания мышью).
Синие точки на кривой соответствуют данным образцов, которые были определены как стандарты, а красные точки показывают данные неизвестных (анализируемых) образцов.
Примечание . При повторном определении стандартов с целью пересчитать кривую стандартов выключение или включение стандартных образцов (цветом) соответственно удалит их данные из расчёта кривой стандартов или добавит их.
Удаление стандартов для улучшения значения R 2 не обосновано, поскольку снижается достоверность полученных результатов. (Наличие стандартов, для которых полученное значение CT не соответствует кривой стандартов, свидетельствует, что значения, полученные для анализируемых образцов также могут быть не корректными).
R2-value (R 2 -значение, коэффициент корреляции) : коэффициент R 2 для кривой стандартов показано в правом верхнем углу каждого окна кривой стандартов.
R 2 – это число (в диапазоне от 0 до 1 ), которое представляет, насколько хорошо линия наибольшего соответствия описывает зависимость между двумя переменными. Иначе говоря, характеризует процент данных, согласующихся со статистической гипотезой, что зависимость между концентрацией и CT для данных стандартов описывается данной линией кривой стандартов. R -значение, равное 0 , подразумевает, что линия не описывает это взаимоотношение. Коэффициент R , равный 1 , показывает, что значения данных попадают прямо на линию наибольшего соответствия, и, следовательно, эта линия даёт хорошее описание зависимости между двумя переменными. Хорошие значения коэффициента R 2 составляют около 0,99 .
Замечание: Можно достигнуть высоких значений R 2 для стандартной кривой построенной по недостаточному объему данных, если было использовано недостаточное количество стандартов. Значение R 2 улучшается при уменьшении числа используемых стандартов, однако это не увеличивает достоверность полученных результатов.
В соответствии с формулой y = mx + b параметры наклон М и отрезок В для кривой стандартов рассчитаны автоматически и показаны в правом верхнем углу окна кривой стандартов.
Наклон, Амплификация, Эффективность Реакции (Slope, Amplification, Reaction efficiency) : Наклон (m) реакции (показанный в окне кривой стандартов) может быть использован для вычисления величин экспоненциальной амплификации и эффективности реакции с помощью следующих уравнений:
Экспоненциальная амплификация = 10 (-1/наклон) или
Эффективность реакции = [10 (-1/наклон) ]-1.
Оптимальные значения для наклона, амплификации и эффективности реакции равны
– 3,322; 2 и 1, соответственно. Эффективность реакции указывается в количественном отчёте.
Наклон рассчитывается делением изменения величины Ct на изменение логарифма входных данных (например, количество копий). Эффективность амплификации 100% означает удвоение продукта амплификации в каждом цикле, результатом чего являются наклон, равный –3,322 , фактор амплификации, равный 2 , и эффективность реакции, равная 1 .
При наклоне равном –3,322 , расчеты будут следующими:
Величина амплификации: 10 (-1/-3,322) = 2,
Эффективность реакции: [10 (-1/-3,322) ]-1 = 1.
Далее приводятся два примера для двух различных значений наклона.
Величина наклона, равная — 3,8 , означает, что реакция характеризуется величиной амплификации примерно 1,83 и эффективностью реакции 0,83 (или 83%).
Для такой величины может быть несколько причин. Если эту величину необходимо улучшить, то можно предпринять такие шаги по оптимизации, как изменение концентрации праймеров или зонда, концентраций MgCl 2 или Sybr-Green I .
Наклон, равный — 3 , означает, что эффективность реакции более 100%. Причиной этого может быть непропорциональное расщепление зонда по отношению к наработанному количеству ампликона. К тому же, если R-значение низкое, то статистическая ошибка может вызвать неправильное значение эффективность реакции.
Export Graph … (Экспорт графика в графическом формате): Щёлкните по правой кнопке мыши на кривой стандартов, чтобы обозначить опцию сохранения графика кривой стандартов в графическом формате (например, JPEG, или GIF).
Overlay (Наложение) . Когда одновременно в одном приборе проводят несколько количественных анализов можно совместить несколько кривых стандартов в одном окне. Эта функция полезна для того, чтобы представить влияние разного уровня пороговой линии на статистические параметры результатов. Ниже представлен пример.
Расчет кривой стандартов
«conc=. *CT + . » Данное уравнение описывает соотношение между значениями СТ и концентрациями ДНК-мишени.
Т ип кривой ( Type) может быть либо плавающим (Floating), либо фиксированным (Fixed). При плавающем типе уравнение оптимальной стандартной кривой вновь рассчитывается, как только Вы меняете порог. При фиксированном типе уравнение не изменяется. Эта опция (фиксированного типа) полезна, если Вы повторно используете кривую стандартов в нескольких анализах, импортируя ее (см раздел Import Curve ).
Меню CT-Calculation (Расчет значений CT): Значение CT образца соответствует значению цикла, при котором кривая амплификации (флуоресценции) образца пересекает пороговую линию. Значения CT для каждого образца определяются посредством установки положения пороговой линии и расчета точки ее пересечения с кривой флуоресценции этого образца.
Меню, используемое для того, чтобы определить уровень пороговой линии или включить автоматический поиск уровня порога для расчета С t и кривой стандартов, находится в правой нижней части экрана, под цветной таблицей обозначения образцов. Если Вы не видите эти опции после нажатия кнопки Std. Curve , щелкните правой кнопкой мыши в основном окне Quantitation Analysis , чтобы они появились.
Threshold ( Порог) (Ручная установка) : Чтобы установить порог, щёлкните по символу (сетка с красной стрелкой) в строке T hreshold , затем нажмите клавишу мыши на графике и перетащите пороговую линию на желаемый уровень или введите значение уровня порога в текстовом окошке в строке T hreshold . При ручной установке для количественного анализа следует выбирать уровень соответствующий экспоненциальному участку кривых амплификации (флуоресценции). При использовании Логарифмической шкалы Log Scale в нижней панели в основном окне, которая установлена по умолчанию, это соответствует линейному участку кривых флуоресценции. При этом уровень пороговой линии должен значительно превышать уровень фона.
В качестве альтернативы можно использовать функцию Auto-Find Threshold (Авто-Поиск Порогового Значения) для автоматической установки оптимального уровня.
Auto-Find Threshold ( Авто-Поиск Порога): Функция автоматического поиска порога просканирует затемнённую область графика, для выбора уровня порога при котором получаются оптимальные статистические параметры для образцов-стандартов (с заданными концентрациями). Вы можете изменить область сканирования, введя новые верхнюю и нижнюю границы в текстовых графах. В большинстве случаев подходит область, заданная по умолчанию. Основываясь на данных, полученных для заданных стандартов, автоматически сканируется ряд пороговых уровней, чтобы получить наиболее подходящую кривую стандартов (то есть, кривую, для которой получено максимальное значение коэффициента корреляции R , приближающееся к 1.0 ).
Eliminate Cycles before (Не учитывать предшествующие циклы до) : Щёлкните по символу (решётка с красной стрелкой) , затем щёлкните на графике, удерживайте щелчок и перетащите пороговую линию вправо. При этом из расчетов исключаются пересечения пороговой линии для начальных циклов. Задать число, не учитываемых начальных циклов можно также введя численное значение в окошке в строке Eliminate Cycles before (Не учитывать начальные циклы).
Примечание. Это полезно, когда существует шум (случайные флуктуации) сигнала в ходе первых циклов .
Import Standard Curve ( Импортировать Кривую Стандартов): Чтобы импортировать кривую стандартов из другого файла анализа или кривую, полученную для другого канала, щёлкните по кнопке Import Curve (Импортировать кривую) в правой нижней части экрана. Тип кривой будет фиксированным. Нажмите кнопку Reset (Переустановка), чтобы обратно изменить тип кривой на плавающий. Ниже показано окно Import Standard Curve
Используя этот экран, Вы можете импортировать кривую стандартов из другого канала, который Вы уже проанализировали в ходе данного анализа, выбрав опцию Current Run (Текущий анализ) , или можете загрузить кривую стандартов из другого анализа, выбрав опцию From Other Run .
Current Run (Текущий анализ): После выбора этой опции, в тестовом поле Channels (Каналы) будут перечислены количественные анализы на других каналах с их соответствующими формулами кривых стандартов.
From Other Run (Из другого анализа) : Выбор этой опции вызовет появление окна, в котором Вы сможете выбрать, какой файл с данными анализа использовать. Если в этом файле был выполнен какой-либо количественный анализ, Вы увидите перечисленные кривые стандартов для каждого проанализированного канала.
Channels (Список каналов): Перечисляет проанализированные каналы и соответствующие им формулы стандартных кривых.
From External Source (Из внешнего источника): воспользовавшись этой опцией, Вы можете напрямую ввести значения параметров М и B для формулы кривой стандартов.
Invert Raw Data (Перевернуть графики исходных данных)
Для некоторых форматов реакции ПЦР c флуоресцентной детекцией, таких как «FRET-гашение» или зонды Bodipy(R), в процессе реакции происходит снижение флуоресцентного сигнала, а не его увеличение. Для анализа таких данных можно использовать данную опцию, пометив галочкой бокс Invert Raw Data. Для всех других видов анализа эта опция не должна быть помечена.
Таблица Результатов / Results
Results (Таблица Результатов) : Эта кнопка в меню открывает таблицу результатов количественного анализа. По умолчанию это окно открывается, когда Вы выполнили анализ Quantitation . Если Вы закроете его, то это окно может быть повторно открыто с помощью этой кнопки в меню основного окна количественного анализа. В таблице результатов в соответствующих столбцах указываются полученные значения соответствующего параметра для каждого из образцов. В таблице ниже можно видеть столбцы, содержащие значения следующих основных параметров: Ct (пороговый цикл), Given Conc . (Заданная концентрация) для образцов-стандартов, Calc . Conc . (Вычисленная концентрация) для всех образцов, CV (коэффициент вариации), Ct Std Dev (Стандартное отклонение Ct ) и некоторые другие статистические параметры (значение которых рассмотрено далее).
Получаемые результаты анализа суммируются в таблице. Щелчок правой кнопкой мыши позволяет экспортировать таблицу в Excel ( Export to Excel) . Нет необходимости предварительно открывать программу Excel, поскольку это будет сделано автоматически. Также можно вставить данные в уже существующий лист Exсel, если выделить нужную часть таблицы результатов и воспользоваться опцией Copy , а затем вставить в нужные ячейки листа Excel.
Важное примечание: пользователь может выбрать, какие колонки таблицы результатов показывать, а какие убрать, щелкнув правой кнопкой мыши по заголовкам колонок, и в спустившемся меню отмечая галочкой нужные ему параметры (сняв галочку, соответственно, можно убрать данные из таблицы).
Объяснение обозначений статистических параметров в таблице результатов.
% Var : Коэффициент вариации между рассчитанной и заданной концентрацией. %Var = Abs ( Calc. Conc. / Given Conc. – 1) х 100%
Rep Ct : Среднее значение Ct для всех образцов с тем же названием (именем)
Rep Ct : Std Dev . : Стандартное отклонение Ct для группы всех образцов с тем же названием.
Rep Ct 95% C . I . : 95% доверительный интервал для значений Ct группы образцов с тем же названием. Это стандартно используемый при количественных анализах статистический показатель. Его величина может быть уменьшена при увеличении количества реплик образца или при меньших вариациях данных по образцам-репликам.
Rep Calc Conc : Расчетная концентрация для группы образцов с тем же названием (именем). Это не среднее расчетных концентраций каждого из образцов, а скорее геометрическое среднее, что является более точной оценкой для этой величины.
Rep Calc Conc 95% C . I . : 95% доверительный интервал для величины концентрации для группы образцов с тем же названием. Учитывает как 95% доверительный интервал концентрации каждого образца, так и модель линейной регрессии, на которой базируется расчет. Его можно интерпретировать так: диапазон концентраций, которые можно получить в 95% случаев, когда выполняется такой же анализ для этих образов при таких же вариациях. Это консервативная оценка и полученная величина диапазона может быть довольно большой, из-за вариаций присущих любому Real-time ПЦР-анализу. Диапазон может быть большим, если значительны вариации между образцами, используется малое количество реплик, или если концентрации образцов далеки от концентраций образцов-стандартов.
ВАЖНО: Вариации, описанные здесь, не связаны с точностью прибора Rotor-Gene 6000, но присущи параметрам процесса экспоненциальной амплификации c детекцией в режиме реального времени. При проведении аналогичных тестов на других приборах для Real-time ПЦР Вы можете получить даже большие показатели вариаций, из-за меньшей однородности температуры в блоке. При перекрестном сравнении результатов, полученных на разных приборах, используйте величину стандартного отклонения Ct, это поддерживается всеми основными производителями.
Чтобы облегчить расчеты, введена функция, которая называется Statistics (Статистика) и автоматически подсчитывает следующие параметры для выделенных образцов: Mean (Среднее) , St d . Dev . ( Standard deviation – Стандартное Отклонение), Min (Минимальное значение) и Max (Максимальное значение) . Просто поместите мышь поверх интересующей Вас области ячеек, и значения статистических параметров выделенной группы образцов будут даны в меню Statistics в правой нижней части окна (под таблицей образцов). В данном случае, приведенном на рисунке, были проанализированы значения Ct образцов c 7 по 9 . Если интересующие Вас образцы не расположены один под другим, то выключите разделяющие их образцы в панели включения/выключения образцов.
Основные опции обработки данных меню Quantitation Analysis
Опции обработки данных представлены в панели инструментов в окне Quantitation Analysis (над графиками нормализованных кривых флуоресценции).
Dynamic Tube ( Динамический фон пробирки) : Эта опция включена по умолчанию и используется, чтобы установить средний фон каждого индивидуального образца на участке, предшествующем логарифмическому участку кривой амплификации. Стандартная Нормализация просто рассматривает значения флуоресценции в первых пяти циклах как индикатор уровня фона каждого образца. Все значения флуоресцентного сигнала, полученные от данного образца, затем делятся на это значение фона, чтобы нормализовать данные. Эта операция повторяется для всех образцов. Этот способ может быть не вполне точным, поскольку уровень фона в течение первых пяти циклов иногда не может быть хорошим показателем фона непосредственно перед логарифмической фазой амплификации. При включении опции «Динамический Фон Пробирки» используется вторая производная кривой каждого образца, чтобы установить для него стартовый номер цикла. Затем уровень фона образца определяется как среднее значений сигнала от первого цикла до этого стартового цикла. Этот метод даёт наиболее точные количественные результаты. В качестве альтернативы для некоторых данных может быть необходимо отключить опцию Dynamic Tube . В этом случае средний уровень фона будет подсчитываться только за первые 5 циклов. Если фон не является постоянным в течение всех циклов перед логарифмической фазой амплификации, то данные будут менее точными.
Slope Correct (Коррекция наклона) : В идеальном случае фоновая флуоресценция (Fl) образца перед началом логарифмической фазы амплификации должна оставаться постоянной. Однако иногда уровень флуоресценции повышается или снижается за счёт происходящих химических реакций и вызывает скошенный уровень помех. Опция «Коррекция Наклона помех» использует наиболее подходящую линию, чтобы аппроксимировать уровень искажений (вместо среднего значения) и проводит нормализацию с учетом помех. Включение этой функции может улучшить статистические параметры данных (уменьшить разброс) , если базовая линия образца заметно наклонена.
Эта функция улучшает данные, когда очевидно, что фон необработанных данных скошен вверх или вниз перед участком логарифмической фазы амплификации, иначе говоря, когда по данным видно, что фон кривой флуоресценции ползёт вверх в течение первых циклов.
Ignore First (Пренебречь первыми): Иногда данные первых нескольких циклов не репрезентативны по отношению ко всей кривой флуоресценции при количественном анализе. Поэтому Вы можете получить более точные результаты, если Вы выберете опцию Ignore First, чтобы пренебречь данными нескольких первых циклов. Если фон в первых циклах не отличается от последующих, то можно получить лучшие результаты, если отключить эту функцию, поскольку алгоритм нормализации будет обрабатывать большее количество данных. Вы можете установить число циклов, которыми следует пренебречь.
Outlier Removal (Удаление Выбросов) : Эти установки на экране количественного анализа позволяют дифференцировать образцы с минорными неспецифическими изменениями флуоресценции от образцов, в которых подлинно регистрируется амплификация ДНК-мишени. Вызвать эту функцию можно с помощью кнопки Outlier Removal (Удаление Выбросов) в панели инструментов главного окна экрана количественного анализа. При этом можно выбрать один из двух механизмов такой дискриминации: опцию NTC Threshold (Порог уровня флуоресценции NTC контролей) или опцию Reaction Efficiency Threshold ( Порог эффективности реакции ). (Примечание: в предыдущих версиях программы опция NTC Threshold вызывалась с помощью кнопки MoreSettings в панели инструментов).
NTC Threshold (Порог уровня флуоресценции NTC контролей): Эти установки на экране количественного анализа позволяют исключить образцы или контрольные образцы NTC (контроли без ДНК матрицы), которые имеют небольшой сдвиг флуоресценции вверх за счёт деградации зонда или других эффектов. Для каждого образца рассматривается изменение абсолютной флуоресценции, выраженное в процентах относительно максимального изменения флуоресценции среди всех образцов. Все образцы, для которых это изменение флуоресцентного сигнала ниже порога NTC Threshold , не включаются в таблицу результатов количественного анализа (рассматриваются как отрицательные).
Например, если у вас есть один образец с максимальным увеличением флуоресцентного сигнала, для которого начальный фон составлял 2FI, а в конце его флуоресценция достигла 47FI, тогда 45FI представляется как 100%. Если выбрать равный 10% NTC Threshold , то 10% от сигнала будет расцениваться как фон (шум сигнала) т.е. для данного примера шумом будет считаться любой сигнал флуоресценции меньше чем 4,5 FI.
Reaction Efficiency Threshold ( Порог эффективности реакции ):
Это альтернативный метод исключения образцов, для который подъем флуоресценции обусловлен неспецифически и является «шумом» сигнала. Этот нормализующий алгоритм использует технику оценки эффективности реакции, применяемую для Сравнительного Количественного Анализа (Comparative Quantitation). При этом исключаются из таблицы результатов все образцы, для которых эффективность реакции ниже определенного уровня. Эффективность, равная 0%, означает, что в логарифмической фазе не происходила специфическая реакция, а эффективность, равная 100%, означает, что реакция происходила с максимальной эффективностью. Отрицательное значение эффективности означает, что флуоресценция образца снижалась, такие образцы, естественно, следует исключать из таблицы, поскольку в них не происходила специфическая реакция.
В настоящее время нет согласованных данных о том, какой уровень эффективности реакции позволяет правильно различать специфическую реакцию и посторонние эффекты. Поэтому мы рекомендуем применять эту опцию с осторожностью, иначе можно аннулировать результат реакции для образцов с невысокой эффективностью реакции, которая, тем не менее, является подлинной (специфической).
В любом случае, применение этой опции невозможно, если нет сильного нарастания флуоресцентного сигнала для образцов, в которых действительно протекает реакция. При использовании некоторых форматов реакции (например, LUX-праймеры), степень нарастания флуоресценции недостаточна, чтобы применять данную опцию. В каждом случае это требует проверки.
Шаблон Количественного Анализа данных
Пользователь может сохранить в виде шаблона настройки нормализации кривых и выбранный уровень порога для анализа, экспортированные с помощью кнопки Export в файл с расширением . QUT . Этот файл можно импортировать кнопкой Import и использовать для приложения такого же анализа данных в других файлах анализа.
8.3 Относительный Количественный Анализ по Двум Кривым Стандартов
Анализ Относительной Экспрессии генов с использованием Гена Нормализации может быть выполнен с помощью Анализа по Двум Кривым Стандартов. Для этого в меню используют кнопку 2 Std Curves ( Rel ).
М етод основан на построении для каждого из генов своей кривой стандартов. По кривой стандартов для каждого из генов вычисляется его концентрация. Экспрессию Гена-Мишени выражают в виде нормализованном по концентрации Гена Нормализации,
в качестве которого обычно используют один из «генов домашнего хозяйства» (housekeeping gene).
Здесь важно правильно определить образцы в таблице образцов, чтобы образцы-стандарты и реплики правильно идентифицировались. Если для анализа используется один канал, то образцы задают в таблице, состоящей из двух страниц: одна для образцов Гена-Мишени, вторая для Гена
Выполнение Относительного Анализа по Двум Кривым Стандартов.
Сначала нужно проанализировать данные по каждому гену с помощью Количественного анализа Quantitation . Если это не сделано, то автоматически такой анализ будет выполнен с использованием опции Авто-выбора уровня Порога.
Далее в меню Analysis выберите 2 Std Curve (Rel) и в окошке щелкните New Analysis. Введите имя анализа.
О бозначьте какие страницы, используются для каждого из генов. Дополнительно можно использовать образец-калибратор (Стандарт). При использовании образца Стандарта, его концентрация принимается за 1 и для всех остальных образцов результаты представляются нормированными относительно этого стандарта.
Требуется обозначить по каким данным (какого канала) выполняются расчеты для Гена-Мишени (Gene of Interest) и для Гена Нормализации (Normaliser). Для этого, щелкнув кнопкой мыши, поставьте галочку в строке Gene of Interest Standard Curve и в появившемся окне выберите нужный вариант, соответствующий каналу и странице в таблице образцов для Гена-Мишени, и нажмите кнопку Select . Аналогично выполните выбор данных для Гена Нормализации, поставив галочку в строке Normalise — r Standard Curve . Если нужно, то обозначьте образец-калибратор, пометив галочкой бокс в строке Calibrator Defined (опционально). Если назначен образец-калибратор, то результаты по всем образцам будут представлены относительно этого образца, результат которого принимается за единицу.
После выбора нужных данных соответствующая опция будет отмечена галочкой.
Нажмите кнопку Reports , откроется окно браузера Reports Browser . Выберите нужный вид анализа и нажмите кнопку Show , чтобы получить отчет о результатах. Выбрав кнопку Export , Вы можете экспортировать результаты в лист Excel.
В последнем окне подготовки отчета будет представлена таблица результатов, включающая для каждого образца рассчитанные по кривой стандартов концентрации Гена-Мишени (колонка GOI Conc.) и Гена Нормализации (Norm. Conc.), а также относи-тельную концентрацию (Relative Conc.). Результаты можно сохранить в файл Word.